綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及分化潛能鑒定

范友芬，潘艷艷，樂欣，晉國營，虞耀華

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）是一類來源于脂肪組織并具有多向分化潛能的干細(xì)胞，廣泛分布于各物種不同部位的脂肪組織中，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表型和多向分化能力。ADSCs具有數(shù)量巨大、取材容易且獲取率高、體外擴增快、細(xì)胞老化率低及免疫原性低等特點[1]，還具有血管原性和抗炎活性，能促進組織新生血管形成[2]。這使得同種異體之間的ADSCs移植變?yōu)榭尚校揖哂袕V泛的臨床應(yīng)用前景。劉相名等[3]從SD大鼠的脂肪組織中獲得了ADSCs，并向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞進行了誘導(dǎo)，體外可穩(wěn)定表達外源基因，證明了其可作為自體移植的一種細(xì)胞來源和基因治療的一種載體。

綠色熒光蛋白（GFP）是在熒光示蹤技術(shù)中廣泛應(yīng)用標(biāo)記細(xì)胞的一種蛋白，具有高效、穩(wěn)定、無細(xì)胞毒性及檢測方便等優(yōu)點[4]。GFP轉(zhuǎn)基因大鼠可系統(tǒng)性表達GFP，可以利用光學(xué)成像技術(shù)跟蹤靶細(xì)胞，廣泛用于研究干細(xì)胞領(lǐng)域。本研究擬建立一種GFP轉(zhuǎn)基因大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)及純化的的方法，并對其細(xì)胞表型和多向分化潛能進行鑒定，以期為后續(xù)ADSCs應(yīng)用于大鼠燒傷創(chuàng)面修復(fù)的研究提供基礎(chǔ)[5]。報道如下。

1　資料與方法

1.1材料 SPF級雌性GFP轉(zhuǎn)基因大鼠3只，4～5周齡；實驗級雌性SD大鼠3只，4周齡；均購于寧波大學(xué)實驗動物中心。FBS高糖DMEM全培、干細(xì)胞完全培養(yǎng)液、成脂誘導(dǎo)液A、成脂誘導(dǎo)液B及成骨誘導(dǎo)液，均為美國Thermo公司產(chǎn)品；PBS、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、抗大鼠CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE單抗、PE-IgG1、FITC-IgG1、茜素紅染色劑及油紅O染色劑等其他試劑，大連TaKaRa公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞分析儀（貝克曼navios，美國）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng) （1）ADSCs的分離：取GFP轉(zhuǎn)基因大鼠，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉滿意后行腹部、雙下肢消毒，無菌超凈工作臺內(nèi)作腹部正中切口并向雙側(cè)腹股溝內(nèi)側(cè)分離，取雙側(cè)脂肪組織并剝除血管組織，縫合切口；以無菌PBS沖洗取出的脂肪組織3次后，再用眼科剪將其剪碎至糊狀，裝入50 ml無菌離心管中。加入2～3倍體積的用PBS預(yù)配的1%Ⅱ型膠原酶，37℃振蕩消化30min，直至脂肪組織呈乳糜狀。離心沉淀5 min后小心取中層液體過200目細(xì)胞篩后，按1∶3比例加入10%FBS高糖DMEM全培終止反應(yīng)，種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）ADSCs的培養(yǎng)：ADSCs分離后第2天PBS沖洗，全量換液，10%FBS高糖DMEM全培培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。待細(xì)胞生長至80%～90%融合時進行傳代。倒置熒光顯微鏡觀察第3代ADSCs的熒光強度衰減情況。

1.2.2大鼠ADSCs的細(xì)胞流式表型鑒定 取第3代的ADSCs，用胰蛋白酶進行消化，將其制備成單細(xì)胞懸液。1×106/ml細(xì)胞分別加入抗大鼠 CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE單抗各1l，PEIgG1、FITC-IgG1為陰性對照。4℃避光孵育30 min，以流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞表型。

1.2.3大鼠ADSCs向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定 （1）成骨細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于6孔板中，每孔約3×103個細(xì)胞，按2ml/孔劑量加入干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，放入溫度37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，24 h后移去培養(yǎng)液，按2 ml/孔劑量加入成骨誘導(dǎo)液；每3天換液1次，如此誘導(dǎo)2～3周；待鈣結(jié)節(jié)形成。成骨誘導(dǎo)后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%異丙醇清洗，加入0.1%的茜素紅染色10min，用PBS沖洗，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。（2）成脂細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定：待ADSCs達到80%～90%融合時，用胰蛋白酶消化后將其接種于6孔板中，每孔約2×104個細(xì)胞，按2 ml/孔劑量加入干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，放入溫度37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)、每3天更換干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，直至細(xì)胞達到100%融合。隨后移去培養(yǎng)液，按2ml/孔劑量加入成脂誘導(dǎo)液A開始誘導(dǎo)，3d后更換為成脂誘導(dǎo)液B維持，24h后再次更換為成脂誘導(dǎo)液A誘導(dǎo)，如此循環(huán)3次；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量增多，但體積相對較小時，可用成脂誘導(dǎo)液B維持3～5d，至脂滴增大。成脂誘導(dǎo)后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%異丙醇清洗，加入2%油紅O染色10min，用PBS沖洗，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4傷口創(chuàng)面示蹤檢測 將SD大鼠按照文獻[6]方法制備大鼠皮膚深度燒傷模型，取ADSCs細(xì)胞懸液（濃度為1×106個/ml）多點注射于大鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)周皮下，在術(shù)后21 d時處死大鼠，常規(guī)消毒鋪單，沿大鼠背部創(chuàng)面范圍用無菌手術(shù)剪剪開皮膚，充分游離皮下后取下雙側(cè)創(chuàng)面皮膚組織，常規(guī)冷凍切片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞定植情況。

2　結(jié)果

2.1ADSCs的分離與培養(yǎng) 成功完成大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)，采用酶消化法得到的ADSCs，1次傳代后在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形細(xì)胞生長，原代及2代細(xì)胞還有少量血細(xì)胞混雜，到第3代則較前明顯純凈（封二彩圖1），細(xì)胞高度表達GFP（封二彩圖2）。3～10代內(nèi)細(xì)胞基本按對數(shù)生長，形態(tài)均一。

2.2ADSCs的鑒定 取P3代ADSCs對其表面特異性標(biāo)記物進行檢測，流式細(xì)胞儀鑒定示：所擴增ADSCs高表達間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物CD29、CD90及CD105；對于造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、白細(xì)胞共同抗原CD45則呈現(xiàn)低表達，細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達與相關(guān)文獻報道基本一致（封二彩圖3）。

2.3ADSCs多向分化能力鑒定 經(jīng)過21 d的成骨分化、成脂細(xì)胞分化實驗，實驗結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞在茜素紅染色后出現(xiàn)了深色鈣結(jié)節(jié)，顯示為成骨細(xì)胞分化陽性（封二彩圖4）。成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞在油紅O染色后，可見胞漿內(nèi)有大小不一的橘黃色脂滴（封二彩圖5），顯示為成脂分化陽性。

2.4傷口創(chuàng)面示蹤檢測結(jié)果 將ADSCs細(xì)胞懸液多點注射于大鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)周皮下21 d后，創(chuàng)面冷凍切片熒光顯微鏡下可見散在點狀綠色熒光（封三彩圖1）。

3　討論

ADSCs作為生物成體間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，其具有多向分化潛能，如分化為脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、表皮、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞等[6-7]。本實驗中分離培養(yǎng)出的GFT轉(zhuǎn)基因大鼠的ADSCs具有良好的分化能力，可向成脂、成骨分化。

據(jù)文獻報道，大鼠腹股溝處皮下脂肪墊是用于提取ADSCs最佳的取材部位，與背部、頸部、附睪、腸系膜及腹腔相比[8-9]，此處脂肪組織最為豐富，便于分離更多的ADSCs，只要盡可能剔除其中的血管和筋膜，避免過多的雜細(xì)胞混入就能提取出較純的ADSCs。本實驗在取材時選取GFT轉(zhuǎn)基因大鼠腹股溝處皮下脂肪墊。本實驗采用酶原消化并差速貼壁的方法成功分離培養(yǎng)ADSCs。因紅細(xì)胞有不貼壁的特性，待ADSCs貼壁后，便可以通過換液去除混雜的紅細(xì)胞的方法來替代裂解液的使用，這樣也避免了裂解液對ADSCs的損傷和影響[10]。同時通過換液和消化傳代可以去除漂浮的脂滴和雜細(xì)胞，使細(xì)胞得以純化。在培養(yǎng)過程中，見ADSCs呈長梭形、漩渦樣生長，傳代后細(xì)胞生長增殖速度快，連續(xù)傳至10代細(xì)胞形態(tài)均無明顯變化。

ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞這一類細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記，表達大量的黏附分子，如持續(xù)表達CD9、整合素 1和4、細(xì)胞間黏附分子1、CD105、血管細(xì)胞黏附分子和活化淋巴細(xì)胞粘附分子，表達Ⅰ類組織相容性蛋白HLA-ABC，但ADSCs并不表達造血細(xì)胞表面標(biāo)志如CD14、CD34或CD45，不表達Ⅱ類組織相容性抗原 HLA-DR及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31，不表達共刺激因子B7-1、B7-2和CD40。ADSCs不表達MHC2Ⅱ類分子和B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，這樣會導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞無法激活，使輔助性T細(xì)胞無反應(yīng)性而促成免疫耐受，從而表現(xiàn)出這一更為重要的生物學(xué)特性—低免疫原性，這就使同種異體ADSCs移植變?yōu)榭赡埽瑥亩鴶[脫了必須自體干細(xì)胞回植的局限，大大提高了實用性。本實驗中，流式細(xì)胞分析結(jié)果證明分離出的ADSCs表面標(biāo)志物符合相關(guān)文獻報道[11]。

近年來，用于細(xì)胞標(biāo)記示蹤的方法主要有熒光染料標(biāo)記法、GFP標(biāo)記法、核酸標(biāo)記法及Y染色體標(biāo)記法等[12]，各有優(yōu)缺點。GFP是來自于南太平洋水母中的一種新型報告基因，具有特異性高、高效穩(wěn)定、無細(xì)胞毒性、檢測方便等優(yōu)點[4]，適于標(biāo)記和示蹤細(xì)胞。GFP轉(zhuǎn)基因大鼠可系統(tǒng)性表達GFP。我國有研究者成功分離培養(yǎng)出了 GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[4]、神經(jīng)干細(xì)胞[13]及胚胎神經(jīng)上皮干細(xì)胞[14]等，也有研究者采用GFP轉(zhuǎn)染法標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[15]，均證明GFP標(biāo)記細(xì)胞簡單易行，對細(xì)胞無毒性，具有良好的應(yīng)用前景。但傳統(tǒng)的示蹤方法是在離體狀態(tài)下通過慢病毒或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光染料來鑒定，且轉(zhuǎn)染效率難以控制，可能會對干細(xì)胞的增殖、分泌、分化功能有影響。GFP轉(zhuǎn)基因純合子大鼠的所有體細(xì)胞均能穩(wěn)定表達綠色熒光，因此本實驗采用提取GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的ADSCs，用于后續(xù)的燒傷創(chuàng)面修復(fù)的研究，對明確外源性ADSCs在其中的作用及機制具有重要意義。本實驗結(jié)果顯示，從GFP轉(zhuǎn)基因大鼠提取的ADSCs能穩(wěn)定表達GFP，熒光顯微鏡下可見第3代細(xì)胞幾乎全部散發(fā)綠色熒光，細(xì)胞移植于燒傷創(chuàng)面后21 d，依然在皮膚創(chuàng)面切片上可見散狀綠色熒光，證明了示蹤效果好。

綜上所述，運用酶原消化并差速貼壁的方法可獲取純度高、生長增殖能力強和具有多向分化潛能的GFP-ADSCs，來源于GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的ADSCs可高度穩(wěn)定表達GFP，且簡單易行，活體移植，定植效果良好，可作為標(biāo)記和示蹤大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的蛋白。

參考文獻：

[1] Taha MF,Hedayati V.Isolation identification and multipotential differentiationof mouseadiposetissue-derived stemcells[J].Tissue&Cell,2010,42(4):211-216.

[2] Zografou A,Papadopoulos O,Tsigris C,et al.Autologous transplantation of adipose-derived stem cells enhances skin graft survival and wound healing in diabetic rats[J].Annals of Plastic Surgery,2013,71(2):225-232.

[4] 劉相名,楊立業(yè),苗宏生,等.脂肪組織來源的多能干細(xì)胞培養(yǎng)和外源基因的表達[J].中華實驗外科雜志,2003,20(2):162-163.

[5] 劉慧娟,胡若愚,戴王娟,等.綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2016,38(1):9-15.

[6] 范友芬,樂欣,晉國營,等.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合人工真皮修復(fù)大鼠深度燒傷創(chuàng)面的研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2017,39(19):1633-1637.

[7] Gimble JM,Katz AJ,Bunnell BA.Adipose-derived stem cells for regenerativemedicine[J].Circ Res，2007，100(9):1249-1260.

[8] Fraser JK,Wulur I,Alfonso Z,etal.Fattissue:anunderappreciated sourceof stem cellsfor biotechnology[J].Trendsin Biotechnology,2006,24(4):150-154.

[9] Schneider G,Baltz K.The effect of exogenous histone H1 on rat adipose-derived stem cell proliferation,migration,and osteogenic differentiationin vitro[J].Journal of Cellular Physiology,2012,227(10):3417-3425.

[10]李玲慧,丁道芳,龔浩,等.大鼠腹腔脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)成骨[J].中國組織工程研究,2013,17(23):4232-4239.

[11]Strem BM,Hicok KC,Zhu M,et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Keio Journal of Medicine,2005,54(3):132.

[12]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315.

[13]周虹,郭杏,李丹,等.大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及CMDiI標(biāo)記后的傳代示蹤[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,51(11):1590-1595.

[14]沈云東,徐建光,徐文東,等.綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外分化與體內(nèi)移植的實驗研究[J].中華手外科雜志,2007,23(4):196-199.

[15]王家增.GFP轉(zhuǎn)基因鼠胚胎神經(jīng)上皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2009,47(9):49-52.

[16]王亭忠,馬愛群,蔣文慧,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2005,26(5):431-434.