結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

何 珍綜述，王 璞審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016）

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的呼吸道傳染病，是全球單一病原體感染導(dǎo)致死亡的第九大原因，位于人類免疫缺陷病毒（HIV）∕艾滋病之前。2016年，全球新發(fā)結(jié)核病例近1 040萬(wàn)例，其中56%在印度、印度尼西亞、中國(guó)、菲律賓、巴基斯坦。約60萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例對(duì)利福平耐藥，其中49萬(wàn)例為耐多藥結(jié)核（MDR-TB）。47%的患者主要分布在印度、中國(guó)和俄羅斯；估計(jì)有近170萬(wàn)例患者死于結(jié)核病[1]。早期、準(zhǔn)確、快速診斷結(jié)核是防治的關(guān)鍵。近年來(lái)，結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)通過(guò)不斷創(chuàng)新取得了新的進(jìn)展。2017年11月新發(fā)布的《WS288-2017肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》更對(duì)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)做出重大調(diào)整，本文就近年來(lái)結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)

1.1 涂片鏡檢

1.1.1 改良抗酸染色 分枝桿菌抗酸染色法快速、簡(jiǎn)易、價(jià)廉，仍為目前應(yīng)用最廣的結(jié)核檢測(cè)方法。該方法主要分為7個(gè)步驟：玻片處理、標(biāo)本收集、標(biāo)本固定、復(fù)紅染色、酒精脫色、美蘭染色、鏡檢觀察。對(duì)任一步驟改進(jìn)均可提高檢測(cè)效率。CHEN等[2]采用粟氏FMMU6型撥片離心沉淀儀處理腦脊液，再用多聚賴酸處理過(guò)的玻片收集其中的白細(xì)胞并用TritonX-100處理，增加了細(xì)胞壁對(duì)染色劑的通透性，使胞內(nèi)菌著色更好，顯著提高了檢出率及敏感性。鄒月麗等[3]采用改良抗酸染色對(duì)腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，將陽(yáng)性率由10.00%提高至88.57%。張繼萍等[4]采用傳統(tǒng)及改良抗酸染色法對(duì)菌陰結(jié)核支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為38%、82%。

1.1.2 熒光染色 利用結(jié)核分枝桿菌的嗜酸性及對(duì)熒光染料的親和性，以石炭酸為媒染劑加入染色液中，使分枝桿菌染上熒光。痰結(jié)核分枝桿菌在熒光顯微鏡20～40倍物鏡暗視野下呈亮綠色熒光，與暗色背景反差明顯；在100倍油鏡下呈桿狀或短棒狀，極易被發(fā)現(xiàn)，不易漏檢[5]。對(duì)于某些患者因長(zhǎng)期服用藥物，使抗酸性遭到破壞的結(jié)核分枝桿菌，其熒光性仍可保留，雖抗酸染色陰性，但在熒光染色后呈陽(yáng)性[6]。熒光染色較抗酸染色陽(yáng)性率高，尤其適用于病變活動(dòng)輕、排菌量較少的患者[7-8]。近年來(lái)，LED熒光顯微鏡的出現(xiàn)，推動(dòng)了熒光染色鏡檢的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的汞燈光源相比，其閱片效果好、閱片時(shí)間短、操作方便，不需要暗室，且光源壽命長(zhǎng)，成本低[9]。CEJUDO-GARCíA 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，將痰涂片經(jīng)紫外線照射固定后再行金胺O熒光染色，可進(jìn)一步提高鏡檢陽(yáng)性率。RYAN等[11]使用新型熒光染料SYBR GOLD對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌涂片進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)率高達(dá)99%。新型微型物鏡與數(shù)字化熒光涂片鏡檢技術(shù)結(jié)合如CellScope、TBDx自動(dòng)顯微鏡系統(tǒng)的研發(fā)，涂片鏡檢具有快速、高效、高通量、全自動(dòng)化、安全性高等優(yōu)勢(shì)[12-14]。

1.1.3 液基夾層杯法 液基夾層杯法與直接涂片法一樣，采用抗酸染色并在顯微鏡下判讀結(jié)果。其創(chuàng)新主要體現(xiàn)在標(biāo)本離心集菌、消化方面[15-17]，標(biāo)本通過(guò)消化滅菌、高速離心等處理后，大量抗酸桿菌沉淀于彭氏夾層杯底部，鏡下菌量顯著增加，提高了檢出率。且經(jīng)過(guò)消化滅菌的結(jié)核桿菌不再具有感染性，加上操作全程在密閉的彭氏杯中進(jìn)行，保障生物安全性。此外，液基夾層杯涂片法還具有標(biāo)準(zhǔn)化程度高、保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。

1.2 分枝桿菌分離培養(yǎng) 分枝桿菌培養(yǎng)為診斷活動(dòng)性結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18]，其靈敏度高于涂片法，可鑒別結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，并對(duì)藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 快速培養(yǎng)基 以羅氏培養(yǎng)法為代表的固體培養(yǎng)法一般需要 4～6周，得到藥敏結(jié)果還需 3～4周。以MGIT 960系統(tǒng)為代表的液體快速培養(yǎng)基將周期縮短至2周左右，且可對(duì)一、二線抗結(jié)核藥物敏感度進(jìn)行檢測(cè)。MGIT960系統(tǒng)生長(zhǎng)培養(yǎng)管底部含有被氧分子抑制的熒光指示劑，當(dāng)氧被分枝桿菌生長(zhǎng)消耗時(shí)，原先被抑制的指示劑被激活從而顯示熒光。目前，常用的培養(yǎng)系統(tǒng)還包括BacT∕ALERT3D液體培養(yǎng)系統(tǒng)、ESP培養(yǎng)系統(tǒng)Ⅱ等，與羅氏培養(yǎng)法相比，它們均顯著縮短了培養(yǎng)時(shí)間，且提高了陽(yáng)性檢出率[19-20]。但液體培養(yǎng)基容易污染[21-22]，且無(wú)法觀察菌落形態(tài)及進(jìn)行定量。且該系統(tǒng)所需試劑和檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴較貴，難以在基層實(shí)驗(yàn)室廣泛開展。

1.2.2 噬菌體生物擴(kuò)增法（PhaB） 分枝桿菌噬菌體只能感染活菌，未進(jìn)入活菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，而已進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在菌體內(nèi)大量增殖，并將菌體裂解，釋放出的子代噬菌體可感染隨后加入的指示細(xì)胞，并將其裂解，出現(xiàn)噬菌斑。通過(guò)檢測(cè)噬菌斑的有無(wú)及數(shù)量，可判斷待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌或其他少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌。譚守勇等[23]使用PhaB對(duì)涂陽(yáng)痰標(biāo)本的利福平耐藥性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PhaB敏感度、特異度及準(zhǔn)確率分別為94.8%、99.0%、98.4%。PhaB檢測(cè)時(shí)間僅需2 d，敏感度高、特異度好，還能根據(jù)噬菌斑的動(dòng)態(tài)變化觀察治療效果；操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器，成本低，對(duì)結(jié)核的診斷及治療具有重要價(jià)值。

1.2.3 薄層瓊脂培養(yǎng)法（TLA） TLA使用固體培養(yǎng)基、顯微鏡來(lái)觀察分枝桿菌菌落生長(zhǎng)，是一種新型的低成本檢測(cè)方法。可根據(jù)鏡下觀察到的特征桿狀表型對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行初步鑒定。TLA與PNB鑒別培養(yǎng)基聯(lián)合檢測(cè)可提高菌種鑒定的特異性。TLA敏感度、特異度與改良羅氏培養(yǎng)法相當(dāng)，檢出時(shí)間為9～11 d[24]。

1.2.4 顯微鏡觀察藥物敏感法（MODS） 結(jié)核分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)會(huì)有特征性索狀結(jié)構(gòu)形成，并可通過(guò)倒置顯微鏡直接觀察，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。張慧漲等[25]發(fā)現(xiàn)，MODS藥敏結(jié)果與羅氏比例法、BECTEC MGIT960法的一致性好，符合率高，檢出時(shí)間僅7 d左右，具有快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)，可作為快速診斷耐藥結(jié)核的重要方法在基層醫(yī)院推廣。

2 免疫學(xué)

2.1 γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs） 當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后可產(chǎn)生特異性記憶T細(xì)胞，再次接觸結(jié)核分枝桿菌時(shí)可產(chǎn)生和分泌γ-干擾素，故可通過(guò)檢測(cè)γ-干擾素來(lái)判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。常用的IGRAs有QuantiFeron-Gold test（GFT-G）和T-SPOT.TB 2種。GFTG通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)再次受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后的記憶T細(xì)胞釋放的γ-干擾素水平進(jìn)行定量檢測(cè)。T-SPOT.TB則利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）測(cè)定在釋放γ-干擾素的效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)目。IGRAs使用的特異度抗原主要為ESAT-6和CFP-10，二者主要存在于MTB，在卡介苗及大多數(shù)NTM中缺失，故特異度高。2種方法均優(yōu)于結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD試驗(yàn)），其中T-SPOT.TB檢測(cè)敏感度更高，而GFT-G檢測(cè)特異度更好[26]；應(yīng)用IGRAs對(duì)免疫功能受損的患者（如HIV感染者）進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（LTBI）篩查優(yōu)于PPD試驗(yàn)[27]，陰性結(jié)果對(duì)排除結(jié)核分枝桿菌感染具有一定幫助。LIAO等[28]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液γ-干擾素水平為同步外周血的4～5倍，其敏感度（95.7%）及特異度（100.0%）均高于外周血（分別為78.3%、86.3%），提示胸腔積液行IGRAs檢測(cè)具有較好的診斷價(jià)值。但I(xiàn)GRAs不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI，也不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)LTBI發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 蛋白芯片 結(jié)核分枝桿菌在增殖過(guò)程中會(huì)釋放出大量特異度抗原刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量抗體。結(jié)核分枝桿菌免疫球蛋白G（IgG）抗體檢測(cè)試劑盒（蛋白芯片）利用微陣列技術(shù)將結(jié)核菌特異性細(xì)胞壁脂多糖抗原（LAM）、經(jīng)基因工程重組DNA技術(shù)生產(chǎn)并純化的蛋白16 kD和蛋白38 kD特異性抗原固定在同一膜片上，與待檢血清快速發(fā)生免疫反應(yīng)，抗原抗體復(fù)合物再與膠體金標(biāo)記的抗人IgG作用，形成紫紅色斑點(diǎn)，再由閱片儀分析，對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診斷[29]。3種抗原中，LAM是分枝桿菌細(xì)胞壁重要成分，含量高，敏感性好[30]；38 kD抗原與16 kD抗原是結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原，與其他分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌不存在交叉反應(yīng)，特異度強(qiáng)[31-32]，半小時(shí)內(nèi)即可出結(jié)果，且結(jié)果由儀器判讀，操作簡(jiǎn)單，可避免人為誤差等。朱同華[33]報(bào)道該方法特異度為96.5%，靈敏度為83.0%。該方法可用于快速診斷結(jié)核病，尤其是菌陰肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎及肺外結(jié)核的診斷[34]。

3 分子生物學(xué)

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP） LAMP利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)肉眼觀察副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的有無(wú)，判斷靶基因是否存在。其靈敏度為92.6%～100.0%，特異度為87.14%～98.00%[24，35-36]。該方法全程所需時(shí)間不足 1 h，對(duì)反應(yīng)條件要求不高，可通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，突破了傳統(tǒng)分子生物檢測(cè)技術(shù)昂貴設(shè)備及繁雜操作要求的限制，是一種適合現(xiàn)場(chǎng)和基層進(jìn)行快速檢測(cè)的方法。也是WHO重點(diǎn)推薦用于結(jié)核病診斷的新技術(shù)[37]。

3.2 分子線性探針技術(shù)（LPA） LPA基于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）原理，將PCR擴(kuò)增、反向雜交和膜顯色技術(shù)合為一體。使用經(jīng)生物素標(biāo)記的引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針雜交，雜交物通過(guò)生物素標(biāo)記的酶發(fā)生顯色反應(yīng)，從而判斷靶DNA特定基因的堿基突變。使用LPA對(duì)MTB進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，具有較高的特異性與準(zhǔn)確率，已得到WHO認(rèn)可與推薦。目前，主要的商業(yè)化LPA試劑盒有INNO-LiPA和GenoType MtbDRplus，均用于一線結(jié)核藥物耐藥性的檢測(cè)，其中GenoType MtbDRplus對(duì)耐利福平、耐異煙肼及耐多藥檢測(cè)的敏感度分別為95.8%、96.3%和97.7%[38]。而新一代 LPA試劑盒 GenoType MtbDRsl可用于快速檢測(cè)乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物和二線注射類藥物耐藥性。

3.3 利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù) （Xpert MTB∕RIF）是集標(biāo)本處理、DNA提取、核酸擴(kuò)增檢測(cè)和RIF耐藥基因檢測(cè)于一體的結(jié)核病和耐藥結(jié)核病快速診斷技術(shù)，2 h內(nèi)即可同時(shí)實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌和RIF耐藥檢測(cè)。全程在封閉環(huán)境中自動(dòng)完成，無(wú)生物安全需求。被WHO譽(yù)為結(jié)核病診斷中革命性突破，是WHO的重點(diǎn)推薦技術(shù)。該技術(shù)以培養(yǎng)結(jié)果及表型藥敏試驗(yàn)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，感度為93.33%，特異度為94.12%[39]。建議對(duì)疑似結(jié)核病患者尤其是疑似MDR-TB患者和合并HIV感染者，首先使用 Xpert Mtb∕RIF技術(shù)檢測(cè)；在MDR-TB或HIV感染率低的地區(qū)，建議使用Xpert Mtb∕RIF技術(shù)對(duì)涂片陰性病例行進(jìn)一步檢測(cè)[40]。

3.4 基因芯片 基因芯片于20世紀(jì)90年代開始用于結(jié)核診斷，隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)已廣泛在臨床上使用?；蛐酒瑢⒋罅刻结樄潭ㄔ谔厥廨d體上，再與待測(cè)樣本的核酸進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒ㄟm用于不同類型標(biāo)本，不需要培養(yǎng)即可進(jìn)行直接分枝桿菌檢測(cè)，并進(jìn)行菌種鑒定，同時(shí)完成耐藥性檢測(cè)。其具有高通量、高效快捷、靈敏度高等特點(diǎn)[41]，可為臨床快速診治分枝桿菌感染、指導(dǎo)治療提供可靠依據(jù)。相關(guān)研究結(jié)果顯示，基因芯片法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為87.26%～92.00%，特異度為96.00%～98.00%；檢測(cè)異煙肼的敏感度為77.4%～81.90%，特異度為 91.70%～96.90%[42-43]。

4 小結(jié)與展望

大多數(shù)因結(jié)核病導(dǎo)致的生命、財(cái)產(chǎn)損失均可以通過(guò)早期診斷和適當(dāng)治療而避免。目前，臨床上可供選擇的MTB檢測(cè)方法眾多，各有其優(yōu)勢(shì)及不足，合理選擇適宜的診斷技術(shù)對(duì)結(jié)核的診斷至關(guān)重要。相信隨著診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步及對(duì)結(jié)核病致病機(jī)制研究的不斷深入，醫(yī)務(wù)工作者會(huì)尋找到性價(jià)比更高的診斷手段為臨床服務(wù)，做到早期診斷并有效治療結(jié)核病。