上皮細(xì)胞?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后和耐藥關(guān)系研究進(jìn)展

彭 娜綜述，康馬飛審校（.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林54000；.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林5400）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者被確診時已處于疾病中、晚期，盡管目前手術(shù)、放療和藥物治療等治療水平在不斷提高，但肺癌患者的病死率仍相當(dāng)高，其主要原因是腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的演變過程，其主要機(jī)制涉及遷移、侵入、黏附、增殖和血管生成等步驟。近年來，越來越多的研究表明，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中扮演著十分重要的角色。本文就EMT在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 EMT的概述及分類

1.1 EMT的概述 1982年GREENBERG在晶體狀體細(xì)胞的研究中首次提出了EMT這一概念，其主要的特征是上皮細(xì)胞連接蛋白如E-鈣黏蛋白的喪失、間充質(zhì)標(biāo)記物（如波形蛋白）的增加和細(xì)胞骨架重組等[1]，通過EMT作用，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性和與基底膜連接的多種上皮表型，從而獲得了遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)等間質(zhì)表型，在多種纖維化疾病、慢性炎癥、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

1.2 EMT的分類 基于EMT發(fā)生的生物學(xué)背景，將其分為3種不同亞型：（1）Ⅰ型與胚胎發(fā)育和器官形成有關(guān)，主要是通過EMT過程產(chǎn)生次級上皮細(xì)胞，從而實現(xiàn)胚胎形成過程中的細(xì)胞類型多樣性。（2）Ⅱ型則是通過產(chǎn)生纖維細(xì)胞來修復(fù)炎癥、創(chuàng)傷所造成的組織損傷，與創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生和器官纖維化有關(guān)。（3）Ⅲ型是指與上皮細(xì)胞發(fā)生相關(guān)的表型轉(zhuǎn)化，從而形成具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞，并保持一定的上皮細(xì)胞特性，隨著血流轉(zhuǎn)移、定植在全身多個組織和器官中。

2 EMT的作用機(jī)制

EMT在肺癌中受多種內(nèi)、外因素的調(diào)控，從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后mRNA加工到翻譯和翻譯后修飾，是一個復(fù)雜的過程。主要EMT步驟包括基因的修飾表達(dá)，以及上皮表型受抑制和間充質(zhì)表型的激活[2]。EMT過程中涉及多種信號通路，如Wnt∕β-連環(huán)蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、Rho∕Rac 和 Src。Ras是一種小 GTP 結(jié)合蛋白，可激活MAPK直接上調(diào)Snail家族表達(dá)，并通過觸發(fā)Rho∕Rac和PI3K等信號誘導(dǎo)EMT[3]。Src能激活MEKMAPK信號通路，并誘導(dǎo)酪氨酸殘基處的β-連環(huán)蛋白磷酸化，促進(jìn)與E-鈣黏蛋白的結(jié)合，降低上皮細(xì)胞極性，誘導(dǎo)EMT[4]。β-連環(huán)蛋白是Wnt信號通路的核心組成部分，研究表明，β-連環(huán)蛋白的缺失及其跟E-鈣黏蛋白的相互作用可能與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后有關(guān)[5]。其包括 E-鈣黏蛋白、PI3K∕Akt和 Ras∕MAPK 通路在內(nèi)的多種生長因子可與Wnt∕β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)相交，以促進(jìn)EMT發(fā)生。因此，腫瘤細(xì)胞失去頂端-基底外側(cè)極化并獲得了間充質(zhì)樣表型，從而增加了其遷移、侵襲和傳播到周圍組織或遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶的能力[6]。

此外，EMT的發(fā)生還需要白細(xì)胞介素-6（IL-6）∕JAK∕STAT3 和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）∕Smad 信號傳導(dǎo)，以及TGF-β和Raf∕MAPK之間的協(xié)同作用。IL-6是JAK∕STAT3和PI3K∕Akt途徑的主要激活劑，在表皮生長因子受體（EGFR）突變的肺腺癌組織中存在IL-6的表達(dá)[7]。有研究證明，抑制IL-6∕STAT3途徑可以使EMT逆轉(zhuǎn)，并使EGFR-TKI耐藥的人肺癌細(xì)胞對埃羅替尼或吉非替尼重新敏感[8]。

有研究認(rèn)為，SAHA作為組蛋白去乙?；敢种苿℉DACIs）的一員，可降低上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)，并增加間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的EMT，使細(xì)胞遷移能力和形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，并最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，增加癌細(xì)胞擴(kuò)散的風(fēng)險。通過siRNA沉默Slug可以逆轉(zhuǎn)SAHA誘導(dǎo)的EMT標(biāo)記物表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[9]。這為肺癌的治療提供了更廣闊的思路?？傊?，EMT是一個復(fù)雜的過程，其具體作用機(jī)制尚不明確。

3 EMT轉(zhuǎn)錄因子與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后

3.1 Snail家族 Snail家族是包括 Snai1和 Snai2（也稱為Slug）的鋅指蛋白，Snail家族是一類非常不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄因子，對翻譯后修飾很敏感，通過羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域與E盒的DNA序列結(jié)合來抑制上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，在EMT的發(fā)生和調(diào)控中扮演重要角色[10]。MERIKALLIO等[11]的一項研究表明，降低Snail表達(dá)可增加 SK-MES1 細(xì)胞系中閉鎖蛋白（claudins）-3、4、7 mRNA的表達(dá)，從而阻礙EMT的進(jìn)展，而Snail低表達(dá)的患者其生存期明顯長于Snail高表達(dá)的患者，提示Snail的表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌患者不良預(yù)后有關(guān)。在MERIKALLIO等[12]的另一項研究中發(fā)現(xiàn)，Slug在Ⅰ～Ⅱ期的肺鱗狀細(xì)胞癌及Ⅲ期肺腺細(xì)胞癌中高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)Slug的表達(dá)只在肺鱗狀細(xì)胞癌中與波形蛋白呈正相關(guān)（P=0.016），在這2種類型的肺癌中，未發(fā)現(xiàn)Slug表達(dá)與腫瘤大小（P=0.49）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.59）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.61）的相關(guān)性。Cox回歸分析表明，Slug的表達(dá)具有獨立的預(yù)后價值（P=0.037），尤其在鱗狀細(xì)胞癌中，Slug高表達(dá)的患者預(yù)后較差（P=0.006，對數(shù)秩）；而在腺癌中，Slug的表達(dá)與生存率無關(guān)（P=0.66，對數(shù)秩）。總之，Snail家族在影響患者生存的肺癌侵襲性方面發(fā)揮著重要作用，敲除該受體將會是肺癌靶向分子治療的一種新選擇。

3.2 ZEB家族 ZEB1、ZEB2同屬于ZEB家族，是具有2個高度保守鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，ZEB蛋白可通過抑制小 RNA（miRNA）-200（miR-200）家族表達(dá)來抑制上皮分化，而miR-200家族反過來也可以抑制ZEB蛋白，形成調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分化的重要雙重負(fù)反饋循環(huán)。非小細(xì)胞肺癌中存在ZEB1、ZEB2的過表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的ZEB1與肺腺癌的腫瘤分級和肺鱗狀細(xì)胞癌的淋巴或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]，而ZEB2的完整性表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后有直接關(guān)系。在MIYAHARA等[13]的報道中，多變量分析結(jié)果表明，彌漫性ZEB1表達(dá)是肺癌獨立的不良預(yù)后因素，其與患者較短的無復(fù)發(fā)（P=0.034）和疾病特異性生存（P=0.031）顯著相關(guān)。有報道稱，接受輔助化療的患者預(yù)后與未接受輔助化療比較無顯著差異，然而與23例輔助化療患者的局部病灶表達(dá)相比，ZEB1的彌漫表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)[14]。在這一觀點上，需要進(jìn)一步研究ZEB1在多形性肺癌中的生物學(xué)功能及ZEB1表達(dá)導(dǎo)致患者預(yù)后差的機(jī)制。這表明ZEB1基因能作為多形性肺癌患者治療的新靶點。

3.3 Twist EMT中的必需轉(zhuǎn)錄因子包括Twist1和Twist2，它們是基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)它們與DNA中靶基因的結(jié)合，促進(jìn)或抑制幾種基因的轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。Twist1的低表達(dá)可使N-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-連環(huán)蛋白和Sox2（NSC標(biāo)志物）的表達(dá)降低，從而抑制EMT[15]。目前，Twist對肺癌的預(yù)后評估仍有爭議。JIANG等[16]研究結(jié)果表明，在38%的患者中發(fā)現(xiàn)有Twist的高表達(dá)，且與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者較差的無復(fù)發(fā)生存期和總生存期相關(guān)。ZHOU等[17]研究結(jié)果顯示，Twist陽性鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率明顯低于Twist陰性患者，此外，在肺鱗狀細(xì)胞癌和T1～2a期腺細(xì)胞癌的亞組分析中，發(fā)現(xiàn)Twist與肺鱗狀細(xì)胞癌的不良預(yù)后相關(guān)，但與肺腺細(xì)胞癌無關(guān)。說明Twist的高表達(dá)并不是肺癌的一個獨立預(yù)后因素。

3.4 波形蛋白 波形蛋白是一種相對分子質(zhì)量為57×103的蛋白質(zhì)，是中間絲蛋白家族的主要成分，該蛋白能被β-鏈蛋白∕TCF反式激活，而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性。研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)存在差異性，重組人聚ADP核糖聚合酶1（PARP1）能結(jié)合波形蛋白的啟動子，并誘導(dǎo)其在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，而波形蛋白過表達(dá)是患者術(shù)后預(yù)后差的獨立預(yù)測因子[18]。根據(jù)其在不同的癌細(xì)胞系和組織中的過度表達(dá)及其在癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移中的相關(guān)性，表明波形蛋白實際上參與并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，并且可以作為癌癥治療的靶點。盡管有研究結(jié)果顯示，某些藥物可以降低波形蛋白水平，但這種影響總是被視為對波形蛋白表達(dá)的間接影響，這是因為多個EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)減少。目前，很少有報道顯示藥物對波形蛋白表達(dá)有直接抑制作用。雖然大多數(shù)上皮細(xì)胞癌在EMT過程中表達(dá)波形蛋白，但波形蛋白的細(xì)胞外位置仍有待研究。

3.5 E-鈣黏蛋白 E-鈣黏蛋白是上皮組織中主要表達(dá)的一種Ⅰ型經(jīng)典鈣黏蛋白，也是形成細(xì)胞-細(xì)胞黏附型連接的關(guān)鍵成分，對維持組織完整性起重要作用。抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)的一個主要機(jī)制是Twist和Snail與E-鈣黏蛋白啟動子中的E-盒結(jié)合，低E-鈣黏蛋白表達(dá)與高Twist表達(dá)相關(guān)，證明了Twist能直接調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白的表達(dá)[19]。有研究報道了肺癌患者基因或表觀遺傳機(jī)制的丟失，常導(dǎo)致細(xì)胞E-鈣黏蛋白功能或表達(dá)異常，而E-鈣黏蛋白功能的喪失與患者的不良預(yù)后相關(guān)[20-21]，這一發(fā)現(xiàn)突出了E-鈣黏蛋白在預(yù)測肺癌患者術(shù)后預(yù)后方面的價值。

4 miRNA與非小細(xì)胞肺癌的EMT

miRNA是由非編碼的18～25個核苷酸組成的單鏈，以mRNA為目標(biāo)進(jìn)而降解和（或）抑制翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼基因的部分或完全沉默。據(jù)報道，許多miRNA具有相似的腫瘤抑制作用，包括miR-138、miR-136和 miR-221等[22]。miR-200家族通過與ZEB1、ZEB2的相互阻遏作用調(diào)節(jié)EMT已得到廣泛研究，吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系與敏感的親代細(xì)胞相比，其中miR-200的表達(dá)下調(diào)，并導(dǎo)致ZEB1、ZEB2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型、干細(xì)胞樣特征和藥物抗性[23]。其他miRNA家族還未像miR-200被廣泛研究，但有證據(jù)表明它們參與了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和原發(fā)組織的EMT。在單個非小細(xì)胞肺癌患者隊列（n=293）中，已證實26%的樣本中miR-9家族的miRNA成員甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默與EMT有關(guān)，且研究表明非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，miR-129-2的相關(guān)甲基化沉默可增加核因子（NF）-κB而促進(jìn)EMT[24]。

5 EMT與NSCLC的藥物抗性

有研究表明，EMT與化療耐藥性有關(guān)，敲除Snail或Twist，鋅指轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵的E-鈣黏蛋白阻遏物分子可導(dǎo)致EMT期間化療敏感性的恢復(fù)[25]。目前，與EGFR相關(guān)的靶向藥物（如厄洛替尼和吉非替尼）已被應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療，但很多患者在治療數(shù)月內(nèi)發(fā)生耐藥現(xiàn)象。有研究學(xué)者常認(rèn)為，非小細(xì)胞肺癌對EGFR藥物的耐藥與EGFR及其他基因突變有關(guān)，包括EGFR突變或活化替代的受體酪氨酸激酶如HER2、HER3、MET、IGF-1R 和 AXL 等。但也有研究發(fā)現(xiàn)，厄替尼治療有效的肺癌患者中存在高水平表達(dá)的脯氨酸羥化酶3（PHD3），并進(jìn)一步證明了TGF-β介導(dǎo)的PHD3失活能通過肺癌細(xì)胞中TGF-α∕EGFR信號通路而促進(jìn)細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移及對厄洛替尼的耐藥性，誘導(dǎo)PHD3的再表達(dá)可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移并使細(xì)胞重新對藥物敏感[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用達(dá)沙替尼（ABL∕Src激酶抑制劑）單藥治療不能逆轉(zhuǎn)肺腺細(xì)胞癌細(xì)胞中的EMT，但用厄洛替尼和達(dá)沙替尼進(jìn)行組合治療可以阻止EMT介導(dǎo)的肺癌耐藥性，但具體機(jī)制尚不明確[27]。通過siRNA或使用蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT-1）抑制劑呋喃二脒敲低p120-catenin和PRMT-1表達(dá)，可增加肺癌細(xì)胞對厄洛替尼的敏感性，并可逆轉(zhuǎn)EMT以克服酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的耐藥性[28]。EMT介導(dǎo)的耐藥性還與AXL受體酪氨酸激酶對下游信號通路的持續(xù)激活有關(guān)[29]，但目前對該通路在腫瘤細(xì)胞藥物抗性方面的機(jī)制還有待充分闡明。SONG等[30]發(fā)現(xiàn)，通過條件激活Twist或重組 TGF-β來誘導(dǎo)EMT后，對EGFR-TKI下調(diào)EGFR磷酸化或下游致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力（即PI3K∕Akt和 MEK∕ERK 途徑）無影響。然而，EGFR-TKI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力卻顯著下降，說明EMT在EGFR-TKI耐藥中的獨特地位。綜上所述，EMT與EGFR-TKI的耐藥性有密切關(guān)系。

6 結(jié) 語

目前，對于EMT的機(jī)制研究已經(jīng)有了進(jìn)展，EMT與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后密切相關(guān)，且可能與耐藥性也有關(guān)，但還需要更多的研究進(jìn)一步明確，特別是用臨床樣品的證據(jù)來證實EMT在肺癌中的作用機(jī)制。