豬精液常溫保存的影響因素分析

孫 超，李 琦，李井春，魏國(guó)生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

21世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)生了翻天覆地的變化，逐漸由原來(lái)以散養(yǎng)戶(hù)為主轉(zhuǎn)變成現(xiàn)在的集約化生產(chǎn)，在此發(fā)展歷程中，人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用［1］。人工授精技術(shù)的核心是對(duì)豬精液的保存，目前保存豬精液的方法可根據(jù)儲(chǔ)存溫度分為3種：第1種是在15～25℃常溫下保存，第2種是0～4℃低溫保存，第3種是超低溫-79℃（干冰）或-196℃（液態(tài)氮）保存。在低溫保存條件下，冷凍豬精液的某些成分會(huì)丟失，導(dǎo)致受精率下降［2］，加之制冷的設(shè)備價(jià)格昂貴，因此，不能在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。與低溫保存的精液相比，常溫保存的精液具有受孕率高、費(fèi)用低、人工操作方便等優(yōu)點(diǎn)，因此，豬精液常溫保存技術(shù)在生產(chǎn)上具有很大的應(yīng)用價(jià)值［3］。然而，精液體外常溫保存能否成功，還取決于稀釋液的組成成分，何種抗氧化劑的添加及其劑量等多種因素［4］。該文主要以常溫保存精液的條件下，對(duì)影響豬精液保存的不同因素進(jìn)行系統(tǒng)綜述，以期為豬精液保存技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。

1 溫度

溫度是外界環(huán)境中影響精子的質(zhì)量最重要的因素［5］。溫度較低時(shí)，精子的活動(dòng)會(huì)減緩，能量消耗降低，有害物質(zhì)的生成減少，抑制精液中微生物的生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)了精液體外的保存時(shí)間。研究表明，豬新鮮精液保存在15～20℃的溫度下，2 d后頂體完整率和精子存活率都優(yōu)于4℃和39℃的效果［6］。鮮紅等［7］發(fā)現(xiàn)，豬精液體外保存適宜的溫度為14～18℃，當(dāng)溫度低于14℃或超過(guò)18℃時(shí)，則會(huì)使精液的體外存活時(shí)間縮短。林峰等［8］研究表明，在相同條件下時(shí)，溫度在15～20℃時(shí)保存精液的效果最好，而在25℃時(shí)的保存效果較差。一般來(lái)說(shuō)，豬精液常溫保存比較理想的溫度為15～18℃，但在實(shí)際生產(chǎn)中通常用16～18℃作為保存溫度，在這個(gè)溫度內(nèi)保存的精子的運(yùn)動(dòng)和代謝水平都會(huì)下降，精子處于休眠的狀態(tài)，但此時(shí)的精子并沒(méi)有喪失活力，精子的結(jié)構(gòu)也沒(méi)有被破壞，當(dāng)精子恢復(fù)在豬體內(nèi)的溫度37℃時(shí)，精子可以恢復(fù)到正常的運(yùn)動(dòng)和代謝水平。

2 精子濃度和稀釋倍數(shù)

精液是由精子和精清組成，精清中含有一些損傷精子功能的物質(zhì)，如精清中的芳基磺胺酶能促使精子獲能，加速其死亡［9］，因此，除去精清或稀釋精液的濃度都有利于精子的保存。當(dāng)精液稀釋后，精子的濃度大小都會(huì)影響精液的保存時(shí)間，精子濃度越高，精子儲(chǔ)存時(shí)間越短；而精子濃度過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致精子失去運(yùn)動(dòng)能力和代謝活性，甚至喪失受精能力［10］。精液的稀釋濃度應(yīng)在適宜的范圍，既要考慮人工授精所需精子的總數(shù)，也要考慮稀釋后精液的體積。在人工授精時(shí)，液態(tài)保存豬精液的正常濃度為3.0×107～5.0×107個(gè)精子/mL時(shí)，可保證每頭母豬受精的總精子數(shù)為3.0×109～4.0×109個(gè)精子/mL以及80～100 mL的適宜精液用量［11］。

3 抗氧化劑

精子的呼吸代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧簇 （ROS），其攜帶有氧自由基，可引起精子過(guò)氧化損傷，并導(dǎo)致精子受精能力下降。因此，可在精液中添加抗氧化劑［3］，抑制精子產(chǎn)生ROS。但不同種類(lèi)的抗氧化劑的作用機(jī)理不同，且不同的抗氧化劑在豬精液中添加的劑量不同，作用效果也不盡相同，因此可根據(jù)不同的需求選擇合適的抗氧化劑。

3.1 谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是一種重要的還原性物質(zhì)，屬非蛋白巰基化合物。GSH主要作用是防止蛋白質(zhì)分子和重要的酶分子被自由基等有害物質(zhì)氧化，因此它可以和ROS發(fā)生反應(yīng)，降低H2O2的濃度，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)起著重要的作用。精液中含有許多種有害的氧化物質(zhì)，因此，GSH可直接與其結(jié)合，生成氧化型谷胱甘肽和水，從而保障精液的品質(zhì)［12］。

3.2 VE

VE在細(xì)胞膜上具有特殊的親和力，可占據(jù)細(xì)胞膜上的特定位置，有效防止過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞膜的損傷，既可以保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，又可提高精子的質(zhì)量，因此，一直作為精子保存期間的抗氧化劑［13］。陳曉英等［14］研究發(fā)現(xiàn)，向稀釋液中加入適量的VE可以降低精子頂體的畸形率，有效減緩?fù)獠凯h(huán)境對(duì)精子的損傷，從而提高精液的品質(zhì)。但到目前為止，豬精液稀釋液中VE的最佳添加劑量仍未有統(tǒng)一的定論，需進(jìn)一步的研究［15］。

3.3 ?；撬?/h3>

牛磺酸（Taurine），也稱(chēng) β－氨基乙磺酸，是一種含硫的非蛋白氨基酸，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，主要以游離的形式存在于動(dòng)物的體內(nèi)，Taurine的主要功能是提高機(jī)體的免疫能力，有效清除自由基，增強(qiáng)細(xì)胞膜的抗氧化能力［16］。謝東淇等［17］發(fā)現(xiàn)稀釋液中添加 5 mmol/L Taurine就能增強(qiáng)精子的存活率，提高頂體的完整率，降低精子的畸形率，保護(hù)質(zhì)膜完整性，進(jìn)而增強(qiáng)其抗氧化性能，最終延長(zhǎng)精子體外的保存時(shí)間。

3.4 牛血清蛋白

牛血清白蛋白（BSA）是一類(lèi)對(duì)精子受精能力有提高的蛋白保護(hù)劑。研究表明，BSA對(duì)精子的保護(hù)作用，主要有以下三個(gè)方面，首先，BSA可以除去精子膜中的部分膽固醇，優(yōu)化質(zhì)膜的脂肪水平，并改變質(zhì)膜的穩(wěn)定性［18］；其次，BSA可以抑制精液中Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)［19］，能夠中和精子和細(xì)菌代謝的副產(chǎn)物，發(fā)揮一定的緩沖和抗氧化的作用［20］；最后，BSA能彌補(bǔ)稀釋精清中蛋白類(lèi)運(yùn)動(dòng)激活物的下降，維持精子的運(yùn)動(dòng)，減少稀釋造成的精子頭部帶相反電性電荷所引起的頭對(duì)頭凝集［9］。

4 稀釋液的pH值

pH值是精子生存環(huán)境的一項(xiàng)重要指標(biāo)。戈新等［21］認(rèn)為，精子在保存過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是酸性的，需要適量的堿性稀釋液進(jìn)行中和，可以有效減少因稀釋液過(guò)酸而導(dǎo)致精子的死亡。侯麗鵬等［22］研究同樣表明，弱堿性稀釋液更有利于精液在17℃保存，這是因?yàn)槿鯄A性稀釋液更符合精子的生存環(huán)境，增強(qiáng)了精液保存效果。

5 緩沖液

緩沖液可以維持稀釋液中pH值的動(dòng)態(tài)平衡，有保護(hù)精子的作用。Johnson 等［12］研究表明，Tris緩沖液具有較強(qiáng)的緩沖能力，對(duì)精子產(chǎn)生的酸性代謝物能起到良好緩沖作用，更利于精子的體外保存。此外，向稀釋液中添加碳酸氫鈉或檸檬酸鈉等緩沖劑可以平衡精子的代謝產(chǎn)物，維持精液pH的相對(duì)穩(wěn)定，促進(jìn)精子的體外保存［3］。

6 其他因素

尿液對(duì)精子也有一定的影響。殘留在泌尿生殖道中的尿液會(huì)伴隨射精與精液一起排出，因此，剛射出的精液應(yīng)舍棄。此外，相當(dāng)多的公豬都會(huì)有包皮腔積尿的問(wèn)題，因此，采精時(shí)，要先把積尿排出之后再采精，盡量保證采精的質(zhì)量。此外，精液運(yùn)輸過(guò)程中，多數(shù)采用加冰袋的泡沫箱運(yùn)輸精液，因此，避免溫差大而使精子死亡，可用紗布包裹輸精瓶，條件允許情況下可以采用車(chē)載冰箱運(yùn)輸。

在實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，精液瓶每天被數(shù)次拿進(jìn)拿出恒溫箱，精液的溫度忽高忽低，對(duì)精子的保存效果具有很大的影響，因此應(yīng)盡量減少開(kāi)關(guān)保存箱門(mén)的次數(shù)和開(kāi)門(mén)的時(shí)間，且操作時(shí)應(yīng)當(dāng)迅速而平穩(wěn)，防止溫度頻繁變化和細(xì)菌交叉感染對(duì)精子造成不良刺激。研究表明，當(dāng)精液保存在常溫恒溫箱中時(shí)，精子將會(huì)于2 h后進(jìn)入休眠狀態(tài)，其代謝會(huì)減緩，從而存活時(shí)間得以延長(zhǎng)。然而，為了避免精子沉淀而造成精子死亡，沉淀的物質(zhì)能夠在稀釋液中均勻分布，且防止其代謝物積累而對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用［23］。因此，在精子儲(chǔ)存期間，應(yīng)每12 h搖勻精液1次，搖動(dòng)時(shí)動(dòng)作要輕緩［24］，劇烈的振蕩會(huì)導(dǎo)致精子從頸部斷裂，形成畸形精子。

7 展望

人工授精是現(xiàn)代畜牧業(yè)的一項(xiàng)重要技術(shù)，精液的保存技術(shù)可以極大地促進(jìn)豬優(yōu)秀基因的擴(kuò)散，還有助于控制某些病原體的傳播。但豬精液體外保存的時(shí)間較短，所以豬精液體外保存技術(shù)還應(yīng)進(jìn)行深入的研究和探討。稀釋液中添加抗氧化劑仍是今后豬精液常溫保存技術(shù)研究中的發(fā)展方向。