神經(jīng)束膜細(xì)胞的發(fā)育及其在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用?

冷 傲 劉 鵬□ 董明慧 楊向群# 劉 芳△

(第二軍醫(yī)大學(xué), 1 學(xué)員旅臨床一隊; 2 解剖學(xué)教研室, 上海 200433)

周圍神經(jīng)的膜性結(jié)構(gòu)包括神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜。其中,神經(jīng)束膜包裹著神經(jīng)內(nèi)大小不等的神經(jīng)纖維束。神經(jīng)束膜又分內(nèi)、外兩層,外層為結(jié)締組織,內(nèi)層由多層扁平上皮樣細(xì)胞構(gòu)成,稱神經(jīng)束膜細(xì)胞。束膜細(xì)胞之間有緊密連接,每層上皮樣細(xì)胞都有基膜[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)束膜上皮僅僅對進(jìn)出神經(jīng)的物質(zhì)起屏障作用,而事實(shí)上,神經(jīng)束膜上皮樣細(xì)胞不是簡單的上皮細(xì)胞。從發(fā)育上說,它起源于胚胎時期中樞的神經(jīng)管結(jié)構(gòu);從功能上說,它對周圍神經(jīng)的發(fā)生以及損傷后的再生有重要的調(diào)控作用。自20世紀(jì)80年代起,神經(jīng)束膜細(xì)胞的研究取得了較大的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除技術(shù)等新的研究方法的引入使得對神經(jīng)束膜細(xì)胞的研究更加深入。目前常用的標(biāo)記神經(jīng)束膜細(xì)胞的分子有Nkx2.2a[2]、Glut-1[3],以及一些緊密連接蛋白[4]如claudin-1、claudin-3、ZO-1、occludin等?，F(xiàn)就神經(jīng)束膜細(xì)胞的發(fā)育及其在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用作一綜述。

1 神經(jīng)束膜細(xì)胞的發(fā)育

周圍神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞在發(fā)育過程中,往往需要經(jīng)過一個長距離的遷移才能到達(dá)目的部位。對于神經(jīng)束膜細(xì)胞而言,探究其來源與遷移對研究其作用尤為重要,而神經(jīng)束膜細(xì)胞自身的活動又對神經(jīng)束、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育有著重要作用。

1.1 神經(jīng)束膜細(xì)胞的來源

對于哺乳動物神經(jīng)束膜細(xì)胞的起源,最初有3種說法,分別源自中胚層、神經(jīng)嵴和神經(jīng)管。早在1989年,Bunge等[5]報道將成纖維細(xì)胞、施萬細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng),可以形成神經(jīng)束膜樣結(jié)構(gòu),推測神經(jīng)束膜細(xì)胞可能與成纖維細(xì)胞相似,起源于中胚層。但后來的研究顯示這種神經(jīng)束膜樣結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞不表達(dá)神經(jīng)束膜細(xì)胞的基因,故這一說法受到了挑戰(zhàn)。Joseph等[6]通過標(biāo)記胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞的方法,表明小鼠神經(jīng)束膜細(xì)胞并非由神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育而來。2014年,Kucenas等[7]采用增強(qiáng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠,顯示大鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)的束膜細(xì)胞中存在著一個Nkx2.2陽性的細(xì)胞亞群,反映了其中樞來源。因此,目前認(rèn)可度較高的觀點(diǎn)是運(yùn)動神經(jīng)的束膜細(xì)胞來源于胚胎時期的神經(jīng)管。而關(guān)于神經(jīng)束膜細(xì)胞來源于神經(jīng)管的具體部位和具體發(fā)育時期,以及感覺神經(jīng)的束膜細(xì)胞的來源等問題,則尚未見報道。

1.2 神經(jīng)束膜細(xì)胞的遷移及機(jī)制

近10年來關(guān)于神經(jīng)束膜細(xì)胞遷移方面的研究取得了一些進(jìn)展。Kucenas等[8]應(yīng)用延時成像技術(shù)研究顯示斑馬魚的神經(jīng)束膜細(xì)胞自脊髓遷出的過程,與施萬細(xì)胞以及運(yùn)動神經(jīng)元軸突相同,均在1個被稱作運(yùn)動神經(jīng)遷出點(diǎn)(motor axon exit points, MEPs)的位置遷出,并且神經(jīng)束膜細(xì)胞的遷出要晚于施萬細(xì)胞[9],目前認(rèn)為主要是Notch通路參與了其中的調(diào)控。Notch通路是一個參與細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生等多個過程調(diào)控的信號通路[10],Edenfeld等[9]對果蠅的研究表明,Notch信號通路與介導(dǎo)束膜細(xì)胞遷移有關(guān)。其中,NotchB-8X或Notchts1基因的突變均可引起束膜細(xì)胞的異常遷移和細(xì)胞形態(tài)的偽足樣變。Notch信號通路還參與調(diào)控脊椎動物周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過程,細(xì)胞膜上的Notch受體被激活,釋放出受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, NICD), NICD轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,與其共因子RPB-Jκ結(jié)合,繼而進(jìn)一步激活后續(xù)靶基因的表達(dá)[10]。在外周神經(jīng)發(fā)育的研究中,Her4和Sox10是研究較多的2個靶基因,它們在施萬細(xì)胞和神經(jīng)束膜細(xì)胞中均高表達(dá),而且隨著細(xì)胞遷移過程的開始而出現(xiàn),隨遷移過程的結(jié)束而消失[11]。

Laura等[11]通過熒光標(biāo)記的方法對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育過程中施萬細(xì)胞和神經(jīng)束膜細(xì)胞分別進(jìn)行觀察研究,顯示在胚胎發(fā)育72h左右,在神經(jīng)嵴軸突遷出點(diǎn)神經(jīng)束膜細(xì)胞的Nkx2.2a和施萬細(xì)胞Sox10的表達(dá)豐度達(dá)到最高,96h開始減少,108h完全消失,這恰與神經(jīng)束膜細(xì)胞的遷出過程相吻合;如在遷移早期24～38h 阻斷Notch通路,神經(jīng)束膜細(xì)胞就會在形態(tài)上發(fā)生偽足樣改變而不會遷出中樞。這一研究提示Notch通路參與調(diào)控神經(jīng)束膜細(xì)胞從中樞遷移到周圍的過程。進(jìn)一步研究表明,在神經(jīng)束膜細(xì)胞遷出中樞之后,在其隨施萬細(xì)胞與運(yùn)動神經(jīng)元移動的過程中,Notch通路信號分子的表達(dá)逐漸下降,即便在此時期阻斷Notch通路,也不會影響神經(jīng)束膜細(xì)胞的運(yùn)動方向和速度;另外,如果在遷移早期阻斷Notch通路而影響了束膜細(xì)胞遷出后,再恢復(fù)Notch通路也無法逆轉(zhuǎn)。這些研究結(jié)果說明Notch通路在神經(jīng)束膜細(xì)胞遷出過程中的作用具有時效性。

1.3 神經(jīng)束膜細(xì)胞的生長及調(diào)節(jié)

目前對于神經(jīng)束膜細(xì)胞生長的影響方面的研究并不多。Yager等[12]研究顯示了一些影響神經(jīng)束膜細(xì)胞生長的基因,如ine-編碼的神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體、eag-編碼的一種鉀通道蛋白、push-編碼的一種包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的膜蛋白、amn-編碼的一種神經(jīng)肽、NF-1-神經(jīng)纖維瘤病相關(guān)基因。他們在對果蠅的實(shí)驗研究中顯示,ine與amn基因?qū)ι窠?jīng)束膜生長有抑制作用。ine蛋白的作用是通過push基因和NF-1基因的表達(dá)產(chǎn)物來協(xié)同實(shí)現(xiàn)的。單純突變ine基因?qū)壣窠?jīng)束膜增厚效果并不顯著,而聯(lián)合突變ine基因和push基因或聯(lián)合突變ine和NF-1基因則會使神經(jīng)束膜明顯增厚; eag基因在對神經(jīng)束膜生長的影響上有與ine基因相似的生物學(xué)效應(yīng),提示此2種蛋白在調(diào)節(jié)機(jī)制上的相關(guān)性。而單獨(dú)的amnX8突變也會產(chǎn)生神經(jīng)束膜的增厚效果。關(guān)于神經(jīng)束膜的生長調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

1.4 神經(jīng)束膜細(xì)胞的作用

自發(fā)育到成熟,神經(jīng)束膜的作用主要體現(xiàn)在兩個方面。第一,神經(jīng)束膜細(xì)胞在發(fā)育過程中參與了運(yùn)動神經(jīng)軸突從中樞遷出與成鞘的過程。早在1986年,Bastiani等[13]對果蠅和蝗蟲的神經(jīng)發(fā)生過程的研究,顯示運(yùn)動神經(jīng)元軸突通過與一種中樞來源的段邊界細(xì)胞(segment boundary cell, SBC)建立聯(lián)系來介導(dǎo)軸突遷出中樞的過程。而對于神經(jīng)束膜細(xì)胞,在明確了其中樞來源之后,研究者們逐漸重視其在周圍神經(jīng)發(fā)生中的作用。Kucenas等[8]報道在斑馬魚的研究中,Nkx2.2a+的束膜細(xì)胞被抑制后,運(yùn)動神經(jīng)元的遷出與成鞘均受到了影響,并通過熒光觀察到束膜細(xì)胞遷出后圍繞軸突的伸縮活動;同時,Edenfeld等[9]在胚胎中阻斷Nkx2.2a陽性細(xì)胞的遷移,也顯示了同樣的現(xiàn)象。這些結(jié)果與之前Bastiani等[13]的研究結(jié)果極其相似,高度提示1986年發(fā)現(xiàn)的SBC正是束膜細(xì)胞。但是介導(dǎo)過程的具體機(jī)制尚未闡明。第二,在軸突遷出與成鞘完成之后,束膜細(xì)胞自身繼續(xù)發(fā)育成熟,參與形成周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)束膜與血-神經(jīng)屏障[14]。

2 神經(jīng)束膜細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用

2.1 神經(jīng)束膜細(xì)胞交聯(lián)成橋促進(jìn)軸突再生

周圍神經(jīng)損傷修復(fù)一直是神經(jīng)生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),與中樞神經(jīng)相比,周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)再生的能力更強(qiáng)。周圍神經(jīng)損傷常見的形式有擠壓傷和軸突橫斷2種,不同形式的損傷所誘發(fā)的修復(fù)過程也不盡相同[13]。軸突橫斷后,受損神經(jīng)元的胞體、斷端及其支配的效應(yīng)器都會經(jīng)歷一系列形態(tài)和生理功能上的改變[8,15-18]： 神經(jīng)元損傷后,細(xì)胞核基因表達(dá)發(fā)生改變,神經(jīng)遞質(zhì)合成減少,再生相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),如β-微管蛋白、生長相關(guān)蛋白43、B50、轉(zhuǎn)錄激活因子3、一氧化氮合酶、熱休克蛋白27等。軸突斷端在損傷后較短時間內(nèi)即發(fā)生急性軸突變性(acute axonal degeneration, AAD),從軸突橫斷到AAD開始的時間間隔長短則因?qū)嶒瀸ο蟛煌虿捎玫妮S突橫斷方法不同而發(fā)生改變,目前尚無定論。AAD發(fā)生于損傷部位兩側(cè)的軸突斷端,軸突降解的89%±2%均發(fā)生于這一階段,隨后降解速度減慢,胞體近側(cè)軸突斷端向胞體回縮。之后,近端軸突的長度基本保持不變,直至再生開始;而遠(yuǎn)端軸突則進(jìn)一步經(jīng)歷Wallerian變性(Wallerian degeneration, WD),軸突內(nèi)部的微管和神經(jīng)纖維發(fā)生分解,軸突與其表面的髓鞘發(fā)生崩解并形成許多碎片狀結(jié)構(gòu)。在此過程中,軸突斷端處的束膜細(xì)胞內(nèi)形成囊泡,在形態(tài)上與吞噬囊泡相一致[19],并與施萬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞發(fā)生相互作用,共同吞噬降解的軸突和髓鞘的裂解片段。此后,損傷部位兩斷端的束膜細(xì)胞發(fā)生增殖并向橫斷部位中央遷移,直至交聯(lián)成橋[19-20],同時誘導(dǎo)施萬細(xì)胞長入并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5、神經(jīng)營養(yǎng)因子-6以及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白,進(jìn)一步誘導(dǎo)近端軸突末端向外生長。若軸突損傷缺口過大或神經(jīng)束膜缺如,則神經(jīng)束膜無法交聯(lián)成橋,軸突也將無法完成再生。

2.2 神經(jīng)束膜細(xì)胞與施萬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的相互作用

研究者們普遍認(rèn)為巨噬細(xì)胞和施萬細(xì)胞在周圍神經(jīng)修復(fù)再生中發(fā)揮著重要作用,而對神經(jīng)束膜細(xì)胞的關(guān)注并不多。近些年的研究表明,神經(jīng)束膜細(xì)胞在損傷修復(fù)中也同樣扮演著關(guān)鍵的角色,并在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中的多個環(huán)節(jié)都與上述2種細(xì)胞有著密切的相互作用。

2.2.1 施萬細(xì)胞幫助神經(jīng)束膜細(xì)胞“感知”神經(jīng)損傷 周圍神經(jīng)損傷后,受損神經(jīng)及其周圍正常神經(jīng)的神經(jīng)束膜細(xì)胞都會分裂增殖并向損傷部位遷移。通過延時成像技術(shù)、變異型分析等手段可以排除受損束膜細(xì)胞殘骸、神經(jīng)元裂解片段和巨噬細(xì)胞在這一過程中的作用。通過對斑馬魚變異型的進(jìn)一步研究表明,在施萬細(xì)胞缺失時,束膜細(xì)胞向損傷部位的遷移及生長會受到嚴(yán)重影響,故推測施萬細(xì)胞或許可輔助束膜細(xì)胞“定位”, 這在神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用[19],但具體機(jī)制目前尚不明確。

2.2.2 神經(jīng)束膜細(xì)胞、施萬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞相互協(xié)調(diào),共同發(fā)揮吞噬作用 及時清除AAD和WD過程中產(chǎn)生的裂解片段對神經(jīng)再生至關(guān)重要,這3種細(xì)胞常常協(xié)同發(fā)揮吞噬功能,但它們在作用時間和空間分布上存在著一定的差異。有研究認(rèn)為在AAD或WD早期,首先由束膜細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用,一段時間之后,巨噬細(xì)胞才在趨化因子的作用下到達(dá)損傷部位,行使吞噬功能[19]。也有研究表明,巨噬細(xì)胞在神經(jīng)元發(fā)生碎片化之前就已到達(dá)損傷部位附近,并且無需施萬細(xì)胞的介導(dǎo)[21]。此外,在損傷早期神經(jīng)束膜細(xì)胞主要在軸突斷端發(fā)揮作用,而巨噬細(xì)胞則相對集中于橫斷裂隙中;在損傷晚期,兩種細(xì)胞的空間分布基本沒有差異。對于施萬細(xì)胞而言,它在時間和空間上的分布與神經(jīng)束膜細(xì)胞相近。

2.2.3 神經(jīng)束膜細(xì)胞通過調(diào)控施萬細(xì)胞的行為促進(jìn)軸突再生[22]周圍神經(jīng)損傷后,施萬細(xì)胞首先去分化形成具有干細(xì)胞特性的前體細(xì)胞,細(xì)胞表面的EphB2受體與束膜細(xì)胞表面的Ephrin-B配體相互作用,觸發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對施萬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Sox2進(jìn)行修飾,最終導(dǎo)致細(xì)胞表面N-鈣黏連蛋白的重新分布,使施萬細(xì)胞與神經(jīng)束膜細(xì)胞之間的排斥作用以及施萬細(xì)胞彼此之間的黏附作用增強(qiáng)。神經(jīng)兩斷端的施萬細(xì)胞增殖分裂并在束膜細(xì)胞的影響下,以多條平行細(xì)胞索的形式遷移至束膜細(xì)胞橋內(nèi),并最終在中間匯合。與此同時,施萬細(xì)胞通過netrin-DCC-Unc5H等機(jī)制,進(jìn)一步引導(dǎo)軸突再生[18]。

2.2.4 調(diào)控機(jī)制 目前對于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)過程中,神經(jīng)束膜細(xì)胞、施萬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用的調(diào)控機(jī)制了解甚少。相關(guān)研究表明[23],在神經(jīng)發(fā)育過程中,施萬細(xì)胞通過表達(dá)沙漠刺猬因子(desert hedgehog, Dhh),作用于束膜細(xì)胞上的受體Patched(ptc),對束膜發(fā)育的完整性發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Dhh和ptc的表達(dá)水平在神經(jīng)發(fā)育成熟后下調(diào),并始終維持在較低水平。而在神經(jīng)損傷再生的過程中,Dhh表達(dá)上調(diào);同時實(shí)驗表明Dhh缺陷小鼠在神經(jīng)損傷后神經(jīng)纖維變性的程度更為嚴(yán)重。據(jù)此可以推測,Dhh在調(diào)控束膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和施萬細(xì)胞的相互作用中或可發(fā)揮著一定作用。

綜上所述,雖然相關(guān)研究肯定了神經(jīng)束膜細(xì)胞在神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用,但尚有一些問題有待解決,如神經(jīng)束膜細(xì)胞與施萬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞協(xié)同發(fā)揮吞噬作用的分子機(jī)制尚不明確。另外,由于神經(jīng)束膜細(xì)胞和施萬細(xì)胞在生長發(fā)育中有著密切的關(guān)聯(lián),故增大了神經(jīng)束膜細(xì)胞的體內(nèi)研究難度。