聲動力療法引起的細胞自噬在腫瘤和動脈粥樣硬化中的研究進展

李 賀，田 野,2，田 振*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 黑龍江 哈爾濱 150001)

聲動力療法(sonodynamic therapy，SDT)是利用超聲波對生物組織有較強的穿透能力，無創(chuàng)傷地將聲波傳播到深部組織，并激活組織吸收的聲敏藥物(如血卟啉)而產(chǎn)生一系列生物學效應(yīng)。單獨使用血卟啉或超聲對小鼠的腫瘤生長無明顯抑制作用，然而血卟啉聯(lián)合超聲(即SDT)卻具有很好的協(xié)同殺傷腫瘤效應(yīng)[1]。SDT能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的巨噬細胞發(fā)生凋亡，對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊也有顯著的療效[2]。目前，SDT誘導(dǎo)細胞凋亡的能力被普遍認可[3]，然而僅僅通過凋亡機制并不能完全解釋SDT的治療作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SDT還可以通過促進細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成而增加細胞自噬[4]。

細胞自噬是真核細胞中特有的一種高度保守的細胞自身內(nèi)容物降解過程，通過細胞自噬泡包裹內(nèi)源性細胞成分 (如氨基酸、 游離脂肪酸和核苷酸等)

并經(jīng)過溶酶體途徑降解，藉此滿足細胞本身的代謝需要和完成某些細胞器的更新[5]。研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬功能紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6- 7]。闡明SDT與細胞自噬的關(guān)系將為指導(dǎo)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 細胞自噬

1.1 細胞自噬的作用

在正常生理條件下，細胞自噬具有維持氨基酸池的穩(wěn)態(tài)、抗衰老、抑制腫瘤、清除胞內(nèi)微生物和調(diào)節(jié)免疫等重要功能。而在刺激條件下，如生理性應(yīng)激刺激(如缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)、激素刺激、藥物(如雷帕霉素)、固有免疫信號和疾病(如微生物感染和心臟病)等，細胞自噬水平要明顯高于基礎(chǔ)水平。此外，細胞自噬功能在神經(jīng)退行性疾病、感染疾病和衰老等疾病中也可能會降低。

1.2 細胞自噬的過程

細胞在刺激作用下，小的囊泡形成杯狀分離膜(也稱吞噬泡)，延長并隨后包裹部分細胞質(zhì)和細胞器，最終形成雙層膜結(jié)構(gòu)——自噬小體(autophagosome)。自噬體外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)。被吞噬的物質(zhì)和自噬溶酶體內(nèi)膜在水解酶和強酸的環(huán)境下變性并被降解為氨基酸、脂肪酸、碳水化合物和核苷酸，隨后運送到細胞質(zhì)供細胞重新利用[8]。超過30種自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)編碼的蛋白參與了吞噬泡延伸、自噬體與溶酶體的融合過程[9- 10]。細胞自噬是一個比較復(fù)雜的動態(tài)過程，因此僅僅檢測微管相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ)和beclin- 1等蛋白的改變并不能完全說明細胞自噬的真實變化。目前,還沒有一種特別簡潔有效的方法能夠直觀的反應(yīng)細胞自噬的變化，所以需要透射電鏡、免疫印跡和熒光標記等多種檢測手段同時使用，增加結(jié)論的可靠性。

2 SDT誘導(dǎo)細胞自噬的機制

SDT是在光動力療法(photodynamic therapy，PDT)理論與技術(shù)的基礎(chǔ)上演變而來的，在腫瘤和動脈粥樣硬化疾病的治療研究中取得了良好的效果[11]。目前，研究認為ROS的產(chǎn)生可能是SDT發(fā)揮作用的基本機制。ROS對細胞具有廣泛的作用，例如，ROS能引起細胞凋亡，也能引起細胞自噬。

2.1 SDT通過產(chǎn)生ROS引起細胞自噬

SDT的影響因素較多，主要包括聲敏劑種類、超聲參數(shù)、細胞類型和實驗條件(如氧氣濃度等)等。由于這些不確定因素和研究手段的限制，對SDT的機制的研究面臨巨大挑戰(zhàn)。目前比較公認的SDT機制之一是超聲空化作用。超聲波產(chǎn)生的小氣泡(空化泡)會隨著周圍的液體的振動而不斷運動、膨脹甚至潰滅?？栈轁鐣r會導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生。聲敏劑在這一過程中起到載體的作用[12]。

SDT可以短時間內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS瞬時就會被分解，然而部分文獻中的ROS高峰卻是在SDT結(jié)束后1～2 h[13]。SDT時，細胞內(nèi)ROS的增多可能與多種因素有關(guān)，例如SDT直接可產(chǎn)生ROS，同時細胞內(nèi)線粒體也可以產(chǎn)生ROS，另外細胞的抗氧化能力也可能下降。因此，SDT所引起的ROS升高有可能是SDT直接產(chǎn)生的，也可能是細胞功能與代謝狀態(tài)改變而間接產(chǎn)生的。SDT促進ROS升高的確切機制仍需要更多的后續(xù)研究進行闡明。

在SDT前使用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理培養(yǎng)的巨噬細胞，SDT引起的細胞自噬被顯著抑制[13]。該結(jié)果說明SDT可以引發(fā)細胞自噬，而產(chǎn)生的ROS可能是引起細胞自噬的重要因素。

2.2 SDT引起細胞自噬的信號通路

SDT提高細胞內(nèi)ROS的含量，通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活細胞自噬。SDT可以顯著提升細胞LC3-Ⅱ和beclin- 1的蛋白表達水平，降低p-AKT、p-mTOR和P62蛋白表達水平，在透射電鏡下可以清晰的觀察到自噬體的獨立雙層膜結(jié)構(gòu)。分別使用PI3K抑制劑、AKT抑制劑和mTOR抑制劑預(yù)處理巨噬細胞, 明顯降低細胞p-AKT、p-mTOR和P62的表達水平，升高LC3-II和beclin- 1的表達[14]。此外，腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK)通路也部分參與了SDT誘導(dǎo)細胞自噬的過程。使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)等自噬抑制劑, 阻斷自噬流，SDT引起的降低炎性反應(yīng)和促進脂質(zhì)代謝的作用消失[13]，說明細胞自噬在SDT治療動脈粥樣硬化疾病中可能發(fā)揮重要作用。

3 SDT引起的細胞自噬對疾病的影響

細胞自噬在不同的疾病中可能發(fā)揮不同的作用，其具體作用與疾病的發(fā)病機制有密切關(guān)系。例如，細胞自噬增高可能會有利于腫瘤細胞的生存[4, 15]，但卻具有抗動脈粥樣硬化進展的作用[16- 17]。

3.1 細胞自噬與腫瘤

SDT最早的應(yīng)用于治療腫瘤，可以特異性的造成癌細胞凋亡和壞死，但同時也會引起細胞自噬的發(fā)生[4, 18]。

細胞自噬最初被認為是一種促存活機制，在不利的環(huán)境下促進細胞存活，但最近的研究表明誘導(dǎo)細胞自噬也可以導(dǎo)致細胞死亡，被稱為自噬性死亡(Ⅱ型程序性細胞死亡)。自噬既能通過抑制凋亡通路而延緩細胞凋亡[19]，也能作為一種程序性死亡方式導(dǎo)致細胞死亡[20]。因此，探討SDT誘導(dǎo)的細胞自噬對殺傷腫瘤細胞的影響，可以為提高抗腫瘤效率提供依據(jù)。

小鼠淋巴細胞白血病L1210細胞在SDT治療0.5 h后細胞自噬被活化。使用自噬抑制劑增加SDT誘導(dǎo)L1210細胞凋亡[21]，結(jié)果說明了在SDT治療L1210細胞中，細胞自噬的作用不是誘發(fā)自噬性死亡，而是抑制凋亡的發(fā)生。

綜上所述， SDT引起的細胞自噬通過對抗SDT的殺傷作用而促進腫瘤細胞的存活，為治療腫瘤增加難度。因此，未來可嘗試使用SDT聯(lián)合自噬抑制劑，可能會增強抗腫瘤的臨床效果。

3.2 細胞自噬與動脈粥樣硬化

提高細胞自噬水平對動脈粥樣硬化有一定治療意義[22]。動脈粥樣硬化是一種慢性炎性反應(yīng)疾病，在早期和發(fā)展期單核巨噬細胞參與炎性反應(yīng)并分泌各種炎性反應(yīng)因子。炎性反應(yīng)活化能導(dǎo)致蛋白酶分泌、組織破壞和斑塊破裂。使用SDT可以明顯減少巨噬細胞白介素- 1β(IL- 1β), 白介素- 12(IL- 12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達和分泌。單純超聲和單純聲敏劑對細胞無明顯影響。使用自噬抑制劑和ROS清除劑可逆轉(zhuǎn)這種改變[14]。細胞自噬能降低巨噬細胞的炎性反應(yīng)，然而是否有炎癥體自噬降解途徑的參與目前還不甚清楚。

隨著動脈粥樣硬化的進展，巨噬細胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，其細胞自噬功能損傷，導(dǎo)致斑塊內(nèi)脂質(zhì)負載和脂質(zhì)無法降解[23]。SDT促進轉(zhuǎn)錄因子TFEB核轉(zhuǎn)位使溶酶體再生，提高細胞自噬，從而抑制脂質(zhì)攝取，增加脂質(zhì)流出。TFEB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子參與細胞內(nèi)調(diào)控多種脂質(zhì)降解相關(guān)基因的表達。SDT后腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)表達水平升高，增加了脂質(zhì)流出；跨膜的白細胞分化抗原36(CD36)和清道夫受體A(SR-A)表達降低，抑制脂質(zhì)攝取，從而達到疾病治療的效果[13]。

4 SDT誘導(dǎo)細胞自噬的優(yōu)勢

SDT誘導(dǎo)細胞自噬具有常規(guī)藥物與PDT不可比擬的優(yōu)勢，該療法具有靶向性強、穿透性深、精準和副作用小等特點。

4.1 靶向性強

借助聲敏劑的組織特異性吸收及超聲波的聚焦控制可實現(xiàn)較高的靶向性。例如，腫瘤具有高代謝特點，可以比正常組織吸收更多的聲敏劑。同時借助超聲治療儀可以將超聲的能量聚集在局部區(qū)域。因此，聲敏劑和超聲的雙重特異性使得SDT調(diào)控細胞自噬具有很強的靶向性。

4.2 穿透性深

PDT穿透深度有限，無法到達人體深部組織，這決定了PDT只能治療表淺的病灶，如皮膚病和乳腺癌等。SDT所使用的超聲是機械波，波長較長，在人體組織傳播時，傳播能量損失小，所以傳播距離大，穿透能力強，可用于心血管疾病或體內(nèi)較深的腫瘤的治療。

4.3 精準性高

根據(jù)疾病的特點，精確調(diào)節(jié)自噬的程度有助于疾病的治療和康復(fù)。隨著醫(yī)學不斷的發(fā)展和科技水平的提升，對疾病的治療不再是一概而論，而是在治療方案中漸漸重視個體之間的差異，即精準醫(yī)學。而利用超聲儀器可以根據(jù)不同個體的組織聲敏劑濃度、氧濃度和聲場分布等特性而調(diào)節(jié)治療的時間、超聲的強度和頻率等參數(shù)，符合精準醫(yī)療的理念。

4.4 其他優(yōu)勢

當前，腫瘤治療的常規(guī)的方法是手術(shù)治療，不但費用昂貴和操作復(fù)雜，而且安全性低，預(yù)后較差。SDT是一種無創(chuàng)的治療方法，對人體的損傷程度很輕，并且可以對手術(shù)不耐受的患者進行治療。

5 問題與展望

SDT作為一種新興的治療技術(shù)，其引起的自噬對腫瘤和動脈粥樣硬化等疾病的治療具有重要影響。SDT對細胞自噬的調(diào)控具有靶向性強和穿透性深等優(yōu)勢。然而，已有的研究仍存在許多不足之處。首先，目前的結(jié)果都是基于體外研究，未來可以更多的采用在體研究，探究SDT對機體的作用；其次，研究內(nèi)容單一，未來可應(yīng)用分子生物學，組學和生物信息學深入挖掘SDT調(diào)控自噬的機制以及細胞自噬的作用?？傊?，SDT的作用和具體機制仍需進一步研究。相信不久的將來，SDT可以作為一種新的治療手段，為臨床服務(wù)。