外泌體在肝癌中的研究進展及應用前景

徐先云，嚴 俊,2,3,4，李 汛，2，3,4*

(1.蘭州大學 第一臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000; 2.蘭州大學第一醫(yī)院 普外五科，甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省生物治療與再生醫(yī)學重點實驗室，甘肅 蘭州 730022; 4.甘肅省肝膽胰研究所，甘肅 蘭州 730000)

肝癌是病死率較高的惡性腫瘤，它的發(fā)病率在所有腫瘤中位于第四位，致死率位列第三位[1]，因此，早發(fā)現、早診斷及早治療對肝癌患者預后具有十分重要的意義，近年來，越來越多的研究表明外泌體(exosome)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和耐藥性等方面發(fā)揮著重要作用，有望在外泌體研究中發(fā)現敏感性及特異性均較高的肝癌早期診斷標志物。本文將從外泌體與肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移、診斷及治療等方面的最新研究進展進行綜述。

1 外泌體的生物學特性

外泌體最早發(fā)現于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中，是由細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到體液中膜性囊泡，外形為圓形或橢圓形，直徑在30～100 nm，其內包涵物質豐富，包括蛋白質、脂質、RNA、miRNA和DNA片段等多種物質，在人體生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，參與細胞間通訊、血管再生、細胞遷移、免疫應答及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。多種細胞均可以分泌外泌體，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、內皮細胞、間充質細胞和腫瘤細胞等；目前研究發(fā)現幾乎可以在任何體液中檢測到外泌體的存在，如血液、唾液、肺泡灌洗液、乳汁、羊水、胸腹腔積液、陰道灌洗液和尿液等體液中[3- 6]。外泌體內涵豐富，其內容物并不是由細胞隨機裝配而分泌到細胞外環(huán)境中，外泌體的分泌受到細胞的精細調節(jié)，其內容物反應了來源細胞的功能，從而實現細胞間的各種信息及物質交換；最新研究發(fā)現，腫瘤細胞所分泌的外泌體其表面蛋白整合素參與外泌體的靶向分泌的過程[7]；腫瘤細胞外泌體的靶向分泌，使腫瘤細胞與周圍組織細胞實現定向物質和信息交換，進而促進腫瘤微環(huán)境的形成，促進腫瘤細胞的遠處轉移及化療免疫。

2 外泌體與肝癌的發(fā)生發(fā)展

相關研究表明外泌體與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移具有密切的關系，甚至在抑制腫瘤方面也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞來源的外泌體可協助腫瘤細胞與基質細胞間進行信息傳遞及物質交換，促進腫瘤微環(huán)境的形成，進而促進腫瘤的增殖及遠處轉移；同時腫瘤細胞所分泌的外泌體可抑制免疫細胞的增殖并促進免疫細胞的凋亡，進而大大減少免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，促進腫瘤免疫耐受。另一方面，免疫細胞所分泌的外泌體，其包含多種腫瘤細胞殺傷物質，這些物質在殺傷腫瘤細胞的同時可進一步激活其他免疫細胞，從而產生更強烈的腫瘤殺傷作用。

2.1 外泌體與肝癌增殖及抑制

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展這過程主要由原癌基因的激活及抑癌基因的沉默所導致的，腫瘤細胞與基質細胞之間通過外泌體進行信息傳遞及物質交換，從而形成特定腫瘤微環(huán)境，進而促進腫瘤細胞的增殖；有研究表明腫瘤分泌的外泌體可促進特定的癌基因在細胞間轉移，進而誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞的增殖[8]。另一相關研究顯示肝癌細胞來源的外泌體，因攜帶大量肝癌特異性抗，可激發(fā)更強烈的腫瘤免疫反應；肝癌細胞所分泌的外泌體可有效增加樹突狀細胞激活，同時增加T淋巴細胞數量，進而提高γ干擾素表達水平，并降低腫瘤部位的白細胞介素- 10及腫瘤生長因子β表達水平，從而抑制肝癌細胞的增殖[9]。

2.2 外泌體與肝癌的侵襲轉移

腫瘤分泌的外泌體在調節(jié)腫瘤微環(huán)境及遺傳物質轉運起著關鍵的作用，進而實現腫瘤細胞的增殖及遠處轉移。惡性腫瘤實現遠處轉移，一方面是從破壞細胞外基質基底膜開始，細胞外基質基底膜的生成與分解受到金屬蛋白酶的調控，而腫瘤來源的外泌體可促進金屬蛋白酶的生成，從而作用于細胞外基質基底膜加速其分解，使腫瘤細胞突破基底膜，實現腫瘤的侵襲及遠處轉移；另一方面，腫瘤細胞通過發(fā)生上皮間質轉化(指細胞失去上皮細胞特性從新獲得間質細胞特性)，導致腫瘤細胞表型和形態(tài)轉變，進而實現腫瘤細胞的侵襲及遠處轉移，相關研究表明外泌體與腫瘤細胞的上皮間質轉化具有密切關系。MAPK信號通路的激活，可使腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化，并且上調細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)和MMP2的表達，進而促進細胞增殖、侵襲和轉移；腫瘤相關成纖維細胞分泌的外泌體含有miRNA- 320a可直接結合其下游靶受體pbx3，miRNA- 320a-pbx3通路可抑制MAPK信號通路的激活，所以miRNA- 320a具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的能力；相關研究表明肝癌患者中腫瘤相關成纖維細胞分泌的外泌體中miRNA- 320a明顯減少，所以miRNA- 320a水平下降與肝癌的侵襲和轉移具有密切關系[10]。

3 外泌體在肝癌中的應用

由于外泌體所攜帶蛋白、脂質和miRNA等具有母細胞特性，幾乎可從任何體液中得到，而且具有磷脂雙分子層模性結構，能很好地保護其內容物不被破壞，近年研究表明外泌體所攜帶的腫瘤來源的物質，可用于腫瘤的早期診斷、耐藥性檢測、預后評估及治療[11]。

3.1 外泌體與肝癌的診斷

目前肝癌的診斷主要分為兩大類技術，一類主要以影像學檢查為主，包括超聲、CT和MRI等；另一類主要以實驗室診斷性標志物檢測為主，包括AFP等；但上述檢測方法均無法對肝癌微小病灶和早期肝癌做出明確診斷。現階段AFP已經被作為肝癌診斷標志物在臨床廣泛應用，但在早期肝癌患者中單獨使用AFP作為診斷標志物的假陽性率高達40%,在晚期肝癌患者中有15%～30%的患者AFP仍處于正常水平[12]。因此迫切需要尋找新的可以代替AFP或者聯合AFP等腫瘤標志物的診斷標志物，來提高早期肝癌的篩查和診斷準確性。研究證明外泌體中許多肝癌特異性miRNA可用于肝癌的早期診斷。相關研究表明慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者的血清外泌體進行檢測，發(fā)現血清外泌體中miRNA- 18a、miRNA- 221、miRNA- 222、miRNA- 18a和miRNA- 224的表達肝癌患者明顯高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者，外泌體中miRNA- 101、miRNA- 122表達肝癌患者比慢性乙型肝炎患者低，在3組患者外泌體中miRNA- 21和miRNA- 93表達水平無顯著性差異，而在血清中3組患者miRNA的表達水平無明顯差異，提示外泌體中特異性mi-RNA可作為肝癌的診斷標志物[13]。相關研究表明miRNA- 21在許多腫瘤的發(fā)生中均具有重要作用，可用于腫瘤的早期診斷，但在血液中miRNA- 21含量極少，不便于檢測，而在腫瘤分泌的外泌體中miRNA- 21含量明顯增高，在肝癌分泌的外泌體中miRNA- 21就具有很高的表達水平，檢測外泌體中的miRNA- 21為肝癌的早期診斷提供可能；miRNA- 21不具有肝癌特異性，如與AFP聯合進行早期肝癌的診斷，可明顯提高其診斷率[14]。有研究表明miRNA- 10b被證實在肝癌組織中表達，且高度表達提示預后不良，miRNA- 10b相比于miRNA- 21在早期肝癌的診斷更具有價值；miRNA- 10b、miRNA- 200A和miRNA- 122與肝硬化的形成具有密切關系，其具有很強調節(jié)上皮間質轉化的作用，進而促進肝硬化的形成；因此在肝硬化相關肝癌的診斷miRNA- 10b、miRNA- 200A和miRNA- 122作為診斷標志物具有很好地敏感性及特異性[15]。

3.2 外泌體與肝癌的治療

間充質干細胞具有分泌大量外泌體的能力，相關研究將間充質干細胞轉染miRNA- 122和miRNA- 199，使其分泌含有miRNA- 122和miRNA- 199的外泌體，在將外泌體與HUh7肝癌細胞共培養(yǎng)，再在細胞培養(yǎng)液中加入5-氟尿嘧啶(5-FU)，發(fā)現加入含有miRNA- 122和miRNA- 199的外泌體的HUh7肝癌細胞對5-FU的敏感性明顯增高，Huh7肝癌細胞增殖速度明顯降低凋亡速度加快；在動物模型中發(fā)現將通過輸注帶有miRNA- 122的間充質干細胞來源的外泌體進行腫瘤原位的注射能有效增加化療藥物的抗腫巧效果[16]。同樣相關研究表明間充質干細胞來源的外泌體可以促進NK細胞的抗腫瘤反應，從而促進NK細胞對肝癌的抑制[17]。相關研究表明通過MS-275(恩替諾特)作用過的外泌體可有效增加NK細胞的細胞毒性通過上調MICA、MICB和HSP70的表達，進而增加NK細胞的抗腫瘤作用，所以MS- 275被認為是一種潛在的抗肝癌藥物。

3.3 外泌體與肝癌的化療耐藥性

肝癌對常規(guī)化療有很高的耐受性，而miRNA- 122對促進肝癌細胞化療敏感性具有重要作用，有效載體介導的miRNA- 122傳遞可能是肝癌化療的一種策略。越來越多的興趣集中在外泌體作為miRNA生物轉移載體。間充質干細胞(MSCs)因具有分泌大量外泌體的能力，相關研究將脂肪間充質干細胞轉染miRNA- 122表達質粒，轉染miRNA- 122表達質粒的間充質干細胞能夠有效地包裝并分泌含有miRNA- 122的外泌體，進而作用于肝癌細胞，從而使肝癌細胞中對化療藥物敏感性的miRNA- 122-target基因表達發(fā)生變化，進而增加化療藥對肝癌的抗腫瘤作用[18]。相關研究表明索拉菲尼和鏈霉素化療藥物作用于肝癌細胞時，可引起肝癌細胞高表達linc-RNA ROR和linc-RNA VLDLR(肝癌細胞在應激反應時所產生的一類長鏈非編碼RNA)，并高度富集于肝癌細胞所分泌的外泌體中，而linc-RNA ROR和linc-RNA VLDLR已證實可明顯減弱化療藥物對腫瘤細胞的細胞毒性及細胞凋亡作用，進而減少肝癌對化療藥物的敏感性[19]。相關研究表明肝癌細胞分泌的外泌體可有效提高肝癌細胞對化療藥物的耐藥性，其可通過激活HGF/c-Met/Akt信號通路(HGF/c-Met/Akt通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色，并參與腫瘤的侵襲和轉移)進而抑制肝癌細胞的凋亡[20]。

3.4 外泌體與肝癌的復發(fā)

相關研究表明外泌體在肝癌的復發(fā)過程中也發(fā)揮著重要作用，肝癌患者肝移植治療后，發(fā)現肝移植后復發(fā)與未復發(fā)的肝癌病例的血清外泌體中miRNA- 718表達存在顯著差異，發(fā)生轉移的患者血清外泌體中miRNA- 718呈低表達，未發(fā)生轉移的患者血清外泌體中miRNA- 718呈高表達，進一步說明miRNA- 718的低表達與肝癌的侵襲性具有相關性，其低表達與肝癌預后不良密切相關[21]。

4 問題與展望

外泌體作為一類細胞間信息及物質傳遞的載體，已越來越受到人們關注，其在許多疾病的發(fā)生及發(fā)展中起到了關鍵作用，對外泌體的進一步研究有助于對相關疾病提早診斷，預測相關疾病發(fā)生及發(fā)展方向，及相關疾病的治療。外泌體與肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移具有密切關系，對于肝癌的早期診斷及治療具有重要意義。但目前為止外泌體在肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移的具體機制仍未研究清楚，許多問題仍未很好地解決，如外泌體與受體細胞靶向結合的機制尚不明確，有待進一步研究；在肝癌發(fā)展的不同階段其所分泌的外泌體內容物是否相同，是否可通過人為干預逆轉其癌變過程。在肝癌的診斷方面，外泌體中所包含的許多miRNA仍具有很大的研究潛力，可為肝癌的早期診斷提供新的思路；在外泌體與肝癌的侵襲及轉移方面，對其作用機制及相關分子通路的進一步研究，可有助于肝癌患者預后的評估，為新一代抗癌藥物的作用靶點提供新思路；在肝癌的治療方面，進一步研究外泌體與肝癌耐藥性形成的相關機制，可提前避免肝癌細胞形成耐藥性，從而可大大提高患者治療效果；另一方面外泌體作為一種靶向的生物載體，可實現抗癌藥物的靶向運輸，進而大大提高抗肝癌藥物的抗癌作用，同時可減少許多不必要的全身化療反應?？傊?，外泌體與肝癌的許多方面仍具有相當大研究潛力。