外泌體生物學(xué)特性及其miRNAs治療心肌梗死的研究進(jìn)展

彭子健 綜述 陳建英 審校

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東湛江524001)

心肌梗死作為冠心病的典型代表嚴(yán)重危害人類健康。中國(guó)居民2002—2015年心肌梗死死亡率總體呈上升趨勢(shì)，而在美國(guó)，每年超過(guò)36萬(wàn)人死于冠心病，其中12萬(wàn)人死于心肌梗死[1]。如何提高梗死區(qū)域心肌細(xì)胞存活率、促進(jìn)血管新生、減輕心肌纖維化及炎癥反應(yīng)、改善梗死后心功能等是心肌梗死研究領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)，干細(xì)胞移植治療心肌梗死初見(jiàn)成效[2]，但其分化為成熟心肌細(xì)胞的概率很低，且移植后3周內(nèi)存活率低至1%，然而干細(xì)胞發(fā)揮的心臟保護(hù)作用卻至少維持了6個(gè)月[3]，提示其保護(hù)效應(yīng)并非依賴于分化作用[4]。隨后的研究證實(shí)，干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌機(jī)制釋放外泌體從而發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)，此外，大量證據(jù)表明干細(xì)胞源性外泌體的心臟保護(hù)作用與其攜帶的miRNAs密切相關(guān)?，F(xiàn)對(duì)外泌體生物學(xué)特性及干細(xì)胞源性外泌體miRNAs在心肌梗死治療中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 外泌體生物學(xué)特性

外泌體(exosomes)是細(xì)胞分泌的直徑為30～150 nm，密度為1.11～1.19 g/mL的脂質(zhì)雙分子層膜囊泡，其內(nèi)含有大量蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)[5]。據(jù)外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta(http://www.exocarta.org/)統(tǒng)計(jì)，目前不同來(lái)源的外泌體內(nèi)已檢測(cè)出9 769種蛋白，2 838種miRNA及1 116種脂質(zhì)。外泌體作為生物活性物質(zhì)的運(yùn)輸載體，在介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，此外，外泌體因其低免疫原性、易于獲取改造等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于心血管疾病的診治研究工作中[6]。

1.1 外泌體的形成、釋放與攝取

不同細(xì)胞來(lái)源或細(xì)胞處于不同微環(huán)境中所分泌的、通過(guò)不同途徑進(jìn)入體內(nèi)的外泌體，其組成成分、分布?xì)w巢及發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)均不盡相同[7]。外泌體的這一異質(zhì)性緣于其復(fù)雜的分泌及作用機(jī)制。細(xì)胞膜以內(nèi)出芽(inward budding)的方式形成早期核內(nèi)體(early endosome)，隨后早期核內(nèi)體界膜(limiting manbrane)內(nèi)陷，形成多個(gè)腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles,ILVs)，此時(shí)包含ILVs的早期核內(nèi)體稱作多泡核內(nèi)體(multivesicular endosomes,MVEs)[8]。大部分的MVEs將與溶酶體、自噬體相融合并最終被降解，而小部分的MVEs將在Rab蛋白家族等協(xié)助下運(yùn)送至細(xì)胞膜并與之融合，最終將ILVs釋放出胞外，而被釋放至細(xì)胞外環(huán)境的ILVs即為外泌體[9]。隨后靶細(xì)胞將會(huì)通過(guò)膜表面配體-受體結(jié)合、胞吞作用或胞膜融合等方式攝取外泌體[10]。大部分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)的外泌體將被溶酶體所降解以供細(xì)胞代謝所需，僅有小部分的外泌體得以釋放出內(nèi)容物，并以此介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)交換[9]。目前關(guān)于多泡核內(nèi)體及外泌體在胞內(nèi)不同命運(yùn)的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，但已有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸所需核內(nèi)體分選復(fù)合物依賴及非依賴性途徑在調(diào)控這一復(fù)雜生物過(guò)程中起著重要作用，其中研究較為透徹的相關(guān)蛋白包括：4次跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(tetraspanin,CD9、CD63、CD81)、ALG-2相互作用蛋白X、腫瘤易感基因101蛋白及熱休克蛋白70等[11]。

1.2 外泌體的提取、鑒定及儲(chǔ)存

當(dāng)前廣泛用于提取外泌體的方法有：超速離心、超濾、聚乙二醇沉淀、密度梯度離心、免疫親和捕獲等，因其提取效果各異，故推薦采用優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的復(fù)合型提取方法以避免脂蛋白、病毒等雜質(zhì)污染[12]。目前認(rèn)為，外泌體的鑒定需通過(guò)電子透射電鏡，納米粒子跟蹤分析及蛋白免疫印記等實(shí)驗(yàn)的相互印證[13]，此外，新近研發(fā)的納米級(jí)側(cè)向位移微流控芯片[14]與超高靈敏流式細(xì)胞儀[15]均被報(bào)道可用于鑒定外泌體，其效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。日常實(shí)踐中，常將外泌體短期保存于4℃或長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80℃的環(huán)境里，而研究表明，外泌體在不同凍存條件下均會(huì)發(fā)生諸如內(nèi)容物丟失、形態(tài)結(jié)構(gòu)變異等生物特性的改變[16]，為此建議選用新鮮提取的外泌體進(jìn)行研究以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及可靠性。

2 干細(xì)胞源性外泌體miRNAs與心肌梗死

干細(xì)胞具備強(qiáng)大的體外擴(kuò)增及旁分泌效應(yīng)，是獲取外泌體的種子細(xì)胞。研究表明，外泌體內(nèi)成熟miRNAs占總RNA含量的41.7%，是介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)交換的關(guān)鍵成分[17]。MiRNA即微小RNA(microRNA)，是一組高度保守的小分子單鏈非編碼RNA，由18～24個(gè)核糖核苷酸組成，主要通過(guò)抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后翻譯從而調(diào)節(jié)機(jī)體重要生命活動(dòng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNAs參與調(diào)控心肌細(xì)胞的存活、增殖及血管新生等一系列心血管重要生理過(guò)程[18]，為此對(duì)近年來(lái)干細(xì)胞源性外泌體miRNAs治療心肌梗死的研究進(jìn)展作一梳理，以供參閱。

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體miRNAs

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)因其來(lái)源廣泛，易于獲取，是制備外泌體的理想母體細(xì)胞。Zhang等[19]通過(guò)miRNA基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，大鼠BMMSC來(lái)源的外泌體可通過(guò)上調(diào)miR-147等17個(gè)miRNAs，下調(diào)miR-326-5p等5個(gè)miRNAs從而調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、Wnt等相關(guān)通路，促進(jìn)大鼠c-kit+心肌干細(xì)胞增殖遷移及血管新生。Shao等[20]則通過(guò)miRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，大鼠BMMSC來(lái)源的外泌體通過(guò)上調(diào)miR-29、miR-24等，下調(diào)miR-130、miR-34等，進(jìn)而調(diào)控Ras、PI3K/Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白等通路，促進(jìn)H2O2氧化應(yīng)激損傷下大鼠胚胎心肌細(xì)胞(H9c2)的存活，減少心肌梗死區(qū)域纖維化及炎癥浸潤(rùn)。此外，Yu等[21]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)心肌轉(zhuǎn)錄因子的大鼠BMMSC，其分泌的外泌體富含miR-19a，可通過(guò)抑制下游靶基因PTEN及Bcl-2相互介導(dǎo)因子的表達(dá)從而激活A(yù)kt/ERK通路，提高大鼠心肌細(xì)胞存活率，改善心肌梗死后心臟收縮功能。Chen等[22]則發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-133a的大鼠BMMSC，其分泌的外泌體富含miR-133a，可通過(guò)抑制下游靶基因Snail-1(鋅指蛋白的一種)的表達(dá)從而促進(jìn)缺氧損傷下BMMSC的存活，減少心肌纖維化。除大鼠來(lái)源的BMMSC外，人體來(lái)源的BMMSC亦備受關(guān)注。Ferguson等[23]通過(guò)miRNA基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，人BMMSC來(lái)源的外泌體高表達(dá)miR-1246等23個(gè)miRNAs，其中miR-199a可通過(guò)作用于靶基因CABLES1進(jìn)而抑制Bax、P53及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)的表達(dá)，減少H2O2刺激下小鼠心肌細(xì)胞的凋亡，而miR-130a-3p則可通過(guò)抑制HOXA5的表達(dá)，增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成管能力。另外，Mayourian等[24]發(fā)現(xiàn)人BMMSC來(lái)源的外泌體可通過(guò)miR-21-5p作用于PI3K通路從而調(diào)控鈣表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮力。

2.2 心臟祖細(xì)胞及心球樣細(xì)胞源性外泌體miRNAs

心臟祖細(xì)胞(CPC)及心球樣細(xì)胞(CDC)因其能夠客觀地反映出心臟梗死區(qū)域發(fā)生的變化而備受關(guān)注。Gray等[25]通過(guò)微陣列分析發(fā)現(xiàn)，大鼠CPC經(jīng)缺氧預(yù)處理后所分泌的外泌體高表達(dá)11個(gè)miRNAs，其中miR-292等7個(gè)miRNAs的差異性表達(dá)在隨后的熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CPC來(lái)源的外泌體可通過(guò)miR-17及miR-210等作用于纖維化相關(guān)基因從而降低結(jié)締組織生長(zhǎng)因子及波形蛋白的表達(dá)，改善心肌纖維化。Xiao等[26]發(fā)現(xiàn)，大鼠CPC經(jīng)H2O2預(yù)處理后所分泌的外泌體富含miR-21，隨后通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-21可與程序性細(xì)胞死亡蛋白4結(jié)合從而抑制其表達(dá)，減少氧化應(yīng)激損傷下H9c2心肌細(xì)胞的凋亡。與大鼠來(lái)源的干細(xì)胞相比，人體來(lái)源的干細(xì)胞更有望用于臨床轉(zhuǎn)化。Tseliou等[27]研究發(fā)現(xiàn)，人CDC來(lái)源的外泌體可通過(guò)傳遞miR-146a-5p等作用于人心肌纖維母細(xì)胞，抑制其分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，促進(jìn)其分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及VEGF從而減輕大鼠心肌纖維化，改善心室重構(gòu)及心功能。另外，Geoffrey等[28]通過(guò)RNA-基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，人CDC來(lái)源的外泌體富含miR-181b，可通過(guò)抑制蛋白激酶C δ的表達(dá)從而調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠、豬)梗死區(qū)域內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。此外，Namazi等[29]發(fā)現(xiàn)，人CDC經(jīng)缺氧預(yù)處理后所分泌的外泌體富含miR-210及miR-130a等具有促血管生成效應(yīng)的miRNAs，可能通過(guò)抑制肝配蛋白A3及HoxA5的表達(dá)，增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管能力從而促進(jìn)新生血管形成。

2.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞源性外泌體miRNAs

目前關(guān)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)與胚胎干細(xì)胞(ESC)的研究相對(duì)較少，可能與其潛在的致瘤、致畸性等安全隱患相關(guān)。Adamiak等[30]將iPS來(lái)源的外泌體與小鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，心肌內(nèi)皮細(xì)胞遷移、存活及血管新生能力增強(qiáng)。在隨后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，通過(guò)心肌內(nèi)注射的方式將外泌體注入小鼠心肌梗死區(qū)域后可有效改善其左心室重構(gòu)及心功能，且效果優(yōu)于iPS。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與iPS比較，外泌體內(nèi)特異性表達(dá)miR-145等33個(gè)miRNAs，可能通過(guò)調(diào)控Wnt、PI3K/Akt、絲裂原激活蛋白激酶、VEGF等通路從而發(fā)揮相應(yīng)的心臟保護(hù)作用。Khan等[31]通過(guò)miRNA基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，小鼠ESC來(lái)源的外泌體特異性表達(dá)59個(gè)miRNAs，其中miR-294可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程從而提高H2O2氧化應(yīng)激損傷下小鼠心臟祖細(xì)胞的存活率及增殖能力。

3 展望

目前關(guān)于干細(xì)胞源性外泌體通過(guò)miRNAs治療心肌梗死的研究層出不窮，但大多只關(guān)注于miRNAs及其下游機(jī)制的探索，而致力于miRNAs上游調(diào)控的研究則相對(duì)較少。最近有關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA與miRNAs之間相互作用的研究已逐步開(kāi)展，有望進(jìn)一步闡明非編碼RNA在心血管領(lǐng)域的作用機(jī)制。當(dāng)前，外泌體的研究仍處于起步階段，如何提高外泌體的分離純度、準(zhǔn)確地對(duì)其亞型進(jìn)行分類[32]以及如何改善外泌體靶向性[33]等將是今后外泌體研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。相信通過(guò)研究人員的不懈努力，外泌體可作為干細(xì)胞治療的替代療法早日應(yīng)用于臨床。