非編碼RNA在膽固醇代謝中的研究進展

李傳偉 綜述 曾春雨 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心內(nèi)科，重慶401220；2.重慶市心血管病研究所，重慶401220)

隨著全球人口老齡化的到來，人類疾病構(gòu)成發(fā)生顯著改變，動脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年增加，動脈粥樣硬化性心血管疾病逐漸成為全球死亡的首位病因。動脈粥樣硬化性心血管疾病的病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化，而高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化最重要的危險因素之一。高膽固醇血癥在動脈硬化的不同階段均發(fā)揮了重要的作用，血流紊亂處內(nèi)皮細胞脂質(zhì)的沉積導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的受損，從而促進炎性細胞的黏附和浸潤。而巨噬細胞在不斷的攝取膽固醇脂質(zhì)的過程中發(fā)生泡沫化并沉積在動脈粥樣硬化斑塊中使斑塊體積不斷的增大，促進了動脈粥樣硬化病變的進展，而分泌的炎性因子則促進了斑塊不穩(wěn)定性增加而導(dǎo)致了急性冠脈綜合征的發(fā)生[1]。

血清膽固醇水平受多種因素的綜合影響，飲食習(xí)慣、遺傳變異、激素水平、運動習(xí)慣、疾病狀態(tài)、藥物干預(yù)等多種因素均可影響血脂的水平，而膽固醇的水平受一系列調(diào)控基因的共同作用，以滿足機體基本的生理需求(細胞膜組分及甾體類激素合成等)，又能避免器官過多的脂質(zhì)沉積。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA在血脂水平的調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用[2]。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)人類僅有不到2%的基因編碼了約2萬種蛋白質(zhì)，而其余的98%的基因不能編碼蛋白質(zhì)及多肽。非編碼RNA根據(jù)分子量的大小可以簡單分為長鏈非編碼(lnc)RNA(>200 nt)和短鏈非編碼RNA(<200 nt)[3]。短鏈非編碼RNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)，miRNA通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)降解復(fù)合體而降解目標基因的mRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，大量的研究已經(jīng)證實miRNA在脂代謝各個階段均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[4]。與之形成鮮明對比的是lncRNA的研究還相對較少。lncRNA長度遠大于miRNA，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性遠勝于miRNA。此外，目前已發(fā)現(xiàn)10萬種以上的lncRNA，數(shù)量亦遠勝于miRNA。另外，lncRNA的調(diào)控機制較miRNA更多樣，近10年的研究證實lncRNA廣泛參與機體多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)，包括生長發(fā)育、造血過程、細胞增殖和凋亡、腫瘤發(fā)生、代謝、基因組印記、染色質(zhì)修飾、病原體感染及免疫反應(yīng)等過程[5-7]。非編碼RNA與其調(diào)控的蛋白編碼基因之間相互作用，形成高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，lncRNA的突變或表達異常與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

1 miRNA對膽固醇代謝的調(diào)控

miRNA廣泛參與了膽固醇的吸收、合成、轉(zhuǎn)運、分解等眾多生理過程，目前已經(jīng)證實約10余種miRNA調(diào)控了膽固醇的代謝。大多數(shù)的miRNA由位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子或基因間的非編碼區(qū)域產(chǎn)生miRNA的前體pri-miRNA，然后于細胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)剪切加工成成熟的miRNA。pri-miRNA的轉(zhuǎn)錄受一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，而這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控miRNA轉(zhuǎn)錄的同時，亦可調(diào)控膽固醇代謝的相關(guān)基因。其中miR-33a/b位于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)2和SREBP1之間。SREBP的前體以SCAP/SREBP2復(fù)合體的形式存在于細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，當細胞內(nèi)膽固醇下降時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SCAP/SREBP2復(fù)合體從Insig-1蛋白上解離，然后SREBP2在156位和158位賴氨酸殘基處發(fā)生修飾和水解，SCAP/SREBP2復(fù)合體在向高爾基體轉(zhuǎn)移的過程中逐漸從SCAP蛋白上解離，從而進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄一系列膽固醇合成相關(guān)基因的表達，如羥甲基戊二酰-輔酶A還原酶、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)受體等而促進膽固醇的合成，使LDL水平增加[8-9]。當SREBP被激活的同時，pri-miR-33亦被激活，使轉(zhuǎn)錄出的miR-33增加。miR-33進入細胞質(zhì)后可以通過同膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵分子腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1，和腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1結(jié)合，通過下調(diào)腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1和腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1抑制了膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，從而降低了高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的水平[10]。因此miRNA與鄰近的基因可以從不同的方面共同調(diào)控膽固醇代謝相關(guān)基因的表達而發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。此外，miRNA可以同時調(diào)控多個靶基因的表達，使不同的生理及病理反應(yīng)發(fā)生相應(yīng)的協(xié)同改變。如miR-33在調(diào)控膽固醇代謝相關(guān)基因的同時，還可以調(diào)控脂肪酸氧化的相關(guān)基因，如肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A、羥?；o酶A脫氫酶、Sirtuin 6、AMP激酶α亞基及胰島素代謝的相關(guān)基因，如胰島素受體底物2，因此miR-33升高后的總效應(yīng)是降低HDL、升高三酰甘油(triglyceride，TG)及加重胰島素抵抗，這也可以部分的解釋為何代謝綜合征具有多種臨床表現(xiàn)(中心性肥胖、高TG、高血壓、高血糖及低HDL-C)，同時也解釋了代謝綜合征患者動脈粥樣硬化風(fēng)險的原因，因為這些臨床表型是在共同的“土壤”中產(chǎn)生，而miRNA在其中扮演了“分子紐帶”的作用。

由于mRNA與miRNA通過7個mer的堿基互補配對結(jié)合，因此基因3’非翻譯區(qū)上可以結(jié)合多個miRNA，同一個膽固醇代謝相關(guān)的基因還可以受多個miRNA共同調(diào)控，如上述的腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1除受miR-33調(diào)控外，還同時受miR-148a、miR-758、miR-128-1、miR-130b、miR-27a/b、miR-10b、miR-144、miR-302a、miR-26及miR-301b等miRNAs調(diào)控[11-14]。這些miRNA與mRNA及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)分子間相互作用，共同形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以維持機體內(nèi)膽固醇的平衡。

2 脂蛋白內(nèi)miRNA 的作用

miRNA除在細胞內(nèi)調(diào)控膽固醇的代謝外，近十年的研究還發(fā)現(xiàn)外周血液循環(huán)中同樣存在多種miRNA。循環(huán)miRNA通過與膜泡結(jié)構(gòu)(微泡、外泌體、囊泡)或蛋白載體(Ago2、NPM1)結(jié)合穩(wěn)定存在，避免被血液中廣泛存在的RNA酶所降解。循環(huán)miRNA可以進入特定細胞胞漿內(nèi)，并影響其靶基因mRNA的翻譯效率，從而調(diào)控細胞功能。循環(huán)miRNA種類和含量的變化反應(yīng)了疾病的狀態(tài)，同時亦參與了疾病的進展。2011年，Vickers等[15]在《Nat Cell Biology》發(fā)表文章證實HDL是一種新的循環(huán)miRNA的蛋白載體，HDL內(nèi)含有多種miRNA，此外LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)內(nèi)亦含有一定數(shù)量的miRNA，且種類及數(shù)量均有別于HDL。HDL通過攜帶miRNA參與了巨噬細胞與肝細胞間的通訊，此外HDL中所含miRNA的頻譜與疾病狀態(tài)是明顯相關(guān)的，在家族性高膽固醇血癥及肥胖患者中，miR-223的含量顯著上升[15]。肝細胞通過清道夫受體-B1受體攝取HDL的同時，可以將HDL中攜帶的miR-223也一同轉(zhuǎn)運進入肝細胞胞漿內(nèi)，并影響了靶基因RhoB mRNA的翻譯效率，從而調(diào)控肝細胞的相關(guān)功能，此外，HDL還可以將其中的miR-223轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細胞，從而抑制細胞間黏附因子1的表達，影響內(nèi)皮細胞炎癥因子的釋放而發(fā)揮抗炎的效應(yīng)[16]。與此同時，miR-223進入肝臟細胞后，還可以通過抑制清道夫受體-B1的表達而調(diào)控肝臟對HDL的攝取，同時還可通過抑制3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1的活性而抑制肝臟膽固醇的合成[17]。脂蛋白能攜帶miRNA與其特殊的結(jié)構(gòu)相關(guān)，LDL主要由載脂蛋白apoB100、膽固醇等構(gòu)成，而HDL則由載脂蛋白apoAI、膽固醇及TG等構(gòu)成。兩者均為球形大分子，分子結(jié)構(gòu)非常相似。脂蛋白中分子極性排列，形成外層親水，內(nèi)層親脂的雙層結(jié)構(gòu)，類似于脂質(zhì)體，因此可以作為內(nèi)源性核酸類物質(zhì)的天然載體[18]。因此，脂蛋白除本身作為膽固醇的載體外，還可以通過內(nèi)部的miRNA參與了多種生理過程的調(diào)節(jié)，這也部分解釋了HDL除具有膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的功能外，還能發(fā)揮抗炎癥、抗氧化、抑制血小板活化、保護內(nèi)皮功能等作用。

3 lncRNA對膽固醇代謝的調(diào)控

與miRNA相比，雖然lncRNA數(shù)量眾多，目前l(fā)ncRNA調(diào)控膽固醇代謝的研究還相對較少，而已經(jīng)揭示其調(diào)控分子機制的lncRNA數(shù)量更是鳳毛麟角，這與lncRNA的本身分子結(jié)構(gòu)和人們以往的研究不足相關(guān)。首先，與mRNA和miRNA不同，lncRNA的表達和分布呈高度的種屬、組織、細胞和發(fā)育階段的特異性，人類的lncRNA中僅有不到20%的lncRNA可以在常見的模式動物上尋找到同源序列，使得其在動物上的過表達或敲除的功能研究陷入了困境。而其組織特異性的表達，大部分的lncRNA主要在睪丸組織中呈高表達，而在常見的易取材的組織中卻呈低表達，使得其在體研究較難開展。而其發(fā)育階段的特異性使得有的lncRNA僅在胚胎發(fā)育的特定階段發(fā)揮作用，如lncRNA XIST介導(dǎo)的X染色體失活，若在常見的腫瘤細胞系中很難復(fù)制到同樣的過程[19]。其次，lncRNA的分子量要遠高于miRNA，其三維分子結(jié)構(gòu)不能簡單的通過堿基的組成而得到推算。而lncRNA作用的靶基因亦不能簡單的通過堿基互補而預(yù)測，同一個lncRNA，其5’端和3’端可結(jié)合不同的蛋白和基因，發(fā)揮不同的調(diào)控作用。最后，lncRNA本身的調(diào)控機制復(fù)雜，已經(jīng)被證實的機制包括：轉(zhuǎn)錄抑制、染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾、RNA剪切、內(nèi)源性siRNA、分子伴侶、小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前體分子、miRNA的分子“海綿”等多種機制在細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中，順式或反式調(diào)控靶基因的表達[20-21]。

既往的一些研究顯示lncRNA在血脂調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，如：小鼠肝臟特異性表達的lnc-LSTR可以同TDP-43形成蛋白復(fù)合體來調(diào)控膽酸合成通路關(guān)鍵基因Cyp8b1的表達，并進而通過FXR核受體而影響載脂蛋白apoC2的表達從而調(diào)控肝臟TG的代謝[22]。而APOA1基因反義鏈上的lncRNA APOA1-AS則可以通過與組蛋白修飾蛋白復(fù)合體中的LSD1及EZH2蛋白亞基結(jié)合改變?nèi)旧w組蛋白甲基化而調(diào)控正義鏈上APOA1的表達[23]。大鼠肝臟內(nèi)lnc-HC可以與hnRNPA2b1結(jié)合從而調(diào)控下游腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1及CYP7A1的表達而負向調(diào)節(jié)膽固醇的水平[24]。lncRNA LeXis 可以與轉(zhuǎn)錄輔助因子RALY結(jié)合，從而抑制膽固醇合成關(guān)鍵基因SREBP2、HMGCS、FDFT1、CYP51等基因的表達，從而降低肝臟膽固醇合成及血清膽固醇水平。同時lncRNA LeXis的轉(zhuǎn)錄受膽固醇代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子肝臟X受體的調(diào)控，從而形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[25]。在巨噬細胞泡沫化過程中，氧化LDL誘導(dǎo)lincRNA-DYNLRB2-2表達增加，并通過GPR119而升高腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1的表達而促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運和抑制炎癥反應(yīng)[26]。而同樣在巨噬細胞泡沫化過程中，RP5-833A20.1通過升高miR-382-5p的表達而抑制核因子 IA表達，從而調(diào)控了細胞內(nèi)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運及炎癥因子的表達[27]。

4 非編碼RNA作為調(diào)脂治療靶點的轉(zhuǎn)化研究

目前對于冠心病等動脈粥樣硬化的高危人群，國內(nèi)外調(diào)脂治療指南均推薦高強度的他汀類藥物或強化他汀類藥物治療以進一步降低心血管事件的殘余風(fēng)險，但是他汀類藥物劑量翻倍的同時，其降低LDL-C的幅度僅增加6%，即他汀類藥物的“6%的原則”。此外，高強度的他汀類藥物治療帶來肝臟損害、橫紋肌溶解等并發(fā)癥的發(fā)生率成倍增加。因此，聯(lián)合其他類型的調(diào)脂藥物治療方案成為進一步降低膽固醇水平的新的治療方向。鑒于非編碼RNA在脂代謝中的重要調(diào)控作用，針對miRNA、lncRNA的轉(zhuǎn)化研究亦已開始進入臨床前研究。

由于常用的嚙齒類動物缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白表達等原因，大小鼠血脂譜表現(xiàn)為高HDL和低LDL，與人類血脂譜相反，故嚙齒類動物常規(guī)高脂喂養(yǎng)較難誘導(dǎo)出動脈粥樣硬化斑塊。因此，針對miRNA干預(yù)的臨床前研究最佳的模型應(yīng)為非人靈長類。Rayner等[28]發(fā)現(xiàn)給予非洲綠猴針對miR-33a和miR-33b的寡核苷酸后，全身miR-33a和miR-33b的表達明顯降低，與此同時，肝臟腺苷三磷酸結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運因子A1表達升高，HDL-C水平明顯升高并持續(xù)12周以上，HDL介導(dǎo)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運亦增加，說明抑制miR-33不僅增加了HDL-C的量，還增強了HDL的功能。同時，給予寡核苷酸后，肝酶、肌酶、膽紅素、肌酐等并沒有明顯的改變，說明寡核苷酸介導(dǎo)的miRNA干擾短期是安全的。目前尚無專門的針對高脂血癥的miRNA臨床研究，但已有miRNA干擾或過表達治療慢性丙型病毒性肝炎等疾病臨床研究正在進行。RG-101是N-乙酰半乳糖胺結(jié)合的抑制miR-122表達的寡核苷酸，在Ⅰ期臨床試驗中(EudraCT臨床試驗注冊號2013-002978-49)，在一次給予2 mg/kg或4 mg/kg的RG-101治療4周后，血清中丙肝病毒量分別下降4.42 log10IU/mL 及5.07 log10IU/mL,甚至有部分治療組病例在76周后血清中病毒量低于了檢測范圍。由于miR-122在肝臟膽固醇的代謝中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，在RG-101組可觀察到總膽固醇有0.9～1.4 mmol/L的降低，此外LDL-C、TG及HDL-C均有不同程度的下降，因此以miR-122作為靶點亦可發(fā)揮調(diào)脂的治療效應(yīng)[29]。Miravirsen是鎖核酸硫代磷酸DNA修飾的miR-122的反義核苷酸，在miravirsen的Ⅱa期臨床試驗中，miravirsen亦表現(xiàn)出強大的抑制丙型肝炎病毒復(fù)制的能力，因此miravirsen將有可能成為第一個被美國食品藥品監(jiān)督局批準上市的miRNA類的藥物[30]。

除抑制miRNA的表達外，還可以通過過表達miRNA發(fā)揮調(diào)脂效應(yīng)，但與抑制miRNA相比，過表達miRNA需要克服的巨大的技術(shù)難題在于如何完整的將miRNA的mimic轉(zhuǎn)移到靶細胞的細胞膜內(nèi)而不被RNA酶所降解。在系統(tǒng)性給予的過程中，需要借助質(zhì)粒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、脂質(zhì)體、納米顆粒等載體進行轉(zhuǎn)染。Mirna Therapeutics公司開發(fā)的miR-Rx34是第一個進入Ⅰ期臨床試驗的以脂質(zhì)體為載體過表達miRNA以針對原發(fā)性肝癌及其他實體腫瘤的藥物，在給予miR-Rx34后，盡管腫瘤組織內(nèi)miR-34a水平明顯升高，但有5例志愿者在研究過程中發(fā)生了嚴重的免疫相關(guān)不良反應(yīng)，因而于2016年9月終止進一步試驗。此外，生物載體(腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒)由于其安全性及倫理問題，目前也僅限于實驗室研究，要進入人體試驗尚有許多問題需要解決。而HDL作為內(nèi)源性的miRNA的載體，與上述的載體相比有許多的優(yōu)勢。首先，HDL作為人體本身存在并大量表達的天然蛋白，可由患者自身提取并回輸入體內(nèi)，其生物安全性要明顯高于生物載體。其次，HDL代謝的相關(guān)途徑及受體已研究得非常透徹，HDL可以通過受體被肝臟所攝取，其次其最理想的靶器官主要為肝臟。最后，HDL在體內(nèi)的代謝時間為數(shù)天，較其他載體相比其體內(nèi)存留時間較短，不必擔(dān)心病毒長期感染的問題。盡管如此，以HDL作為載體還有一些關(guān)鍵問題需要解決。首先，天然的HDL攜帶的miRNA量有限，一旦被消耗需持續(xù)的補充。其次，同一個miRNA可干擾不同的基因，其功能多樣性很難達到分子特異性干預(yù)的目的。另外，不同脂蛋白之間存在脂質(zhì)的交換，其所攜帶的miRNA是否也發(fā)生了交換，目前尚不清楚。 最后，HDL攜帶miRNA后亦有可能改變分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥的激活。目前由于lncRNA調(diào)控脂代謝的研究還處于起步階段，更多的還集中在基礎(chǔ)研究，很多l(xiāng)ncRNA的機制還不清楚，因此針對lncRNA的臨床研究尚未開展。

5 結(jié)論及展望

以miRNA及l(fā)ncRNA為代表的非編碼RNA是脂代謝重要的調(diào)控分子，非編碼RNA在膽固醇的消化、吸收、合成、轉(zhuǎn)運及分解等各個階段均發(fā)揮了重要的作用。不斷的基礎(chǔ)及臨床研究不但能夠揭示非編碼RNA在脂代謝中的分子機制，而且有望發(fā)現(xiàn)新一代降脂藥物的作用靶點。如何加快基礎(chǔ)研究結(jié)果的轉(zhuǎn)化，成為造福眾多患者的利器，將是今后基礎(chǔ)研究者及臨床工作者的重點關(guān)注方向。