MicroRNA在心肌纖維化中的研究進(jìn)展

朱永翔 李烽 張耀庭 王彤 綜述 龍明智 審校

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇南京210011)

心功能的維持依賴于心臟的收縮和舒張，而該過程由心肌細(xì)胞的功能和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)決定。心肌纖維化是心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CF)激活后，合成和分泌過多的ECM如Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白(collagen 1，Col-1；collagen 3，Col-3)等沉積于心肌組織中[1]。過量的ECM沉積會(huì)導(dǎo)致心肌僵硬、心律失常和心功能下降，是缺血性心臟病、高血壓、心肌病等發(fā)生心臟重構(gòu)重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，其最終的結(jié)局是心功能衰竭。因此，抑制ECM過度沉積是預(yù)防心肌纖維化、避免心功能衰竭的重要措施，也是當(dāng)前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

MicroRNA(miRNA，miR)是一類序列高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，由21～23個(gè)核苷酸組成。原始miRNA在細(xì)胞核內(nèi)RNA酶Drosha的作用下形成前體miRNA，之后前體miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，并在另一種RNA酶Dicer的作用下成為成熟的miRNA。成熟的miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平特異性地識(shí)別并結(jié)合mRNA的靶位點(diǎn)——3’端非編碼區(qū)，通過抑制或降解特定靶基因的mRNA而發(fā)揮調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的作用。目前，在人類基因組中已鑒定出 2 000 多種 miRNA，參與60%以上基因的表達(dá)調(diào)控。

miRNA與心血管疾病的關(guān)系密切[2]，近年來大量研究證實(shí)，miRNA在動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心肌肥厚、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的病理機(jī)制和發(fā)展演變中扮演了重要角色。在心肌纖維化方面其分子機(jī)制更為復(fù)雜，近年來與心肌纖維化相關(guān)的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，其在心肌纖維化病理進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制也逐漸被認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)就miRNA在心肌纖維化中的研究進(jìn)展，包括miRNA作為心肌纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物、miRNA調(diào)控心肌纖維化的信號(hào)通路，以及miRNA成為心肌纖維化的潛在治療靶點(diǎn)等方面做一綜述。

1 miRNA作為心肌纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物

既往研究表明，循環(huán)miRNA可作為多種心血管疾病的生物學(xué)標(biāo)志物?？紤]到心肌纖維化過程受到miRNA的調(diào)控，近來研究者對心肌纖維化患者的循環(huán)miRNA水平進(jìn)行了檢測，數(shù)個(gè)miRNA分子脫穎而出，其含量的變化被證實(shí)與心肌纖維化相關(guān)，可作為心肌纖維化的候選生物學(xué)標(biāo)志物。

在小鼠模型中，miR-21與壓力超負(fù)荷引起的心肌纖維化有關(guān)。受此啟發(fā)，Villar等[3]在主動(dòng)脈狹窄患者中研究了壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的ECM非適應(yīng)性重構(gòu)與miR-21的關(guān)系，以及miR-21作為反映心肌纖維化病理狀態(tài)生物學(xué)標(biāo)志物的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈狹窄組與對照組相比，心肌和血漿中miR-21水平明顯更高，且與超聲心動(dòng)圖顯示的跨瓣壓差直接相關(guān)。另外，多元線性回歸提示，心肌膠原表達(dá)程度可以通過心肌或血漿中的miR-21所預(yù)測。由此可見，miRNA不僅調(diào)控主動(dòng)脈狹窄患者壓力超負(fù)荷后心肌纖維化的過程，更是在預(yù)測和評價(jià)心肌纖維化方面具有重要價(jià)值。

除了主動(dòng)脈狹窄壓力超負(fù)荷患者，Roncarati等[4]還檢測了肥厚型心肌病患者血漿中一系列miRNA的表達(dá)水平，并進(jìn)一步確定了其中可以作為心肌纖維化生物標(biāo)志物的miRNA。檢測發(fā)現(xiàn)，肥厚型心肌病患者血漿中有多種miRNA表達(dá)明顯升高，而其中僅miR-29a的水平同時(shí)與心肌肥厚和心肌纖維化相關(guān)。研究者強(qiáng)調(diào)因?yàn)閙iR-29a的表達(dá)不具有心臟特異性，若將其作為心臟重構(gòu)與纖維化標(biāo)志物，還需進(jìn)一步明確miR-29a在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)差異。

類似的還有Fang等[5]也評估了miRNA作為肥厚型心肌病患者彌漫性心肌纖維化生物學(xué)標(biāo)志物的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，彌漫性心肌纖維化患者血漿中表達(dá)水平明顯增加的miRNA多達(dá)14種。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)單個(gè)miRNA對于診斷彌漫性心肌纖維化具有中等強(qiáng)度的預(yù)測力[曲線下面積(area under curve，AUC)0.663～0.742]。而logistic回歸分析提示miRNA聯(lián)合檢測可提高預(yù)測力，采用向后逐步選擇法建立logistic回歸模型，模型提供了8個(gè)miRNA聯(lián)合(miR-18a-5p、miR-30d-5p、miR-21-5p、miR-193-5p、miR-10b-5p、miR-15a-5p、miR-296-5p和miR-29a-3p)作為預(yù)測指標(biāo)，具有高度的預(yù)測力(AUC=0.87)。

2 miRNA調(diào)控心肌纖維化的機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA通過不同通路參與了心肌纖維化的調(diào)控；但目前研究證據(jù)充分的miRNA并不多，miR-21、miR-24、miR-29、miR-208、miR-214等是研究較多的幾種。另外，其他多個(gè)miRNA調(diào)控心肌纖維化的機(jī)制雖有研究，但尚需進(jìn)一步證實(shí)。

miR-21促心肌纖維化的機(jī)制得到了充分的研究。Dong等[6-7]的報(bào)告均證實(shí)，抑制CF中miR-21/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號(hào)通路具有抗心肌肥厚和纖維化的作用。研究者[8]還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-21會(huì)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，減緩纖維化心肌細(xì)胞的凋亡，推動(dòng)射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭的發(fā)展。此外，Cao等[9]證實(shí)細(xì)胞黏附分子1是miR-21潛在的靶標(biāo)。miR-21能增強(qiáng)CF中信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路，通過抑制細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)促進(jìn)纖維化進(jìn)展。

心肌纖維化被認(rèn)為是心血管事件鏈中心肌梗死發(fā)展為心力衰竭的關(guān)鍵因素。有報(bào)道指出[10]，心肌梗死后心臟中miR-24表達(dá)會(huì)下調(diào)，且miR-24水平的變化與ECM重構(gòu)關(guān)系密切。體外試驗(yàn)中，miR-24過表達(dá)會(huì)減弱轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)分泌和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Smad2/3磷酸化，妨礙CF的分化和遷移，降低纖維化程度。生物學(xué)信息分析證實(shí)控制TGF-β活化的furin蛋白是miR-24的潛在靶點(diǎn)。研究提示miR-24通過furin/TGF-β信號(hào)途徑調(diào)控心肌梗死后的CF功能和纖維化進(jìn)展。

MiR-29家族直接作用于ECM中不同蛋白的mRNA，具有很強(qiáng)的抗纖維化作用[11]。抑制大鼠CF中miR-29a的表達(dá)會(huì)上調(diào)miR-29a靶蛋白血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)表達(dá)。而CF轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物后則出現(xiàn)相反的結(jié)果，且抑制了CF的增殖。據(jù)此推測miR-29a通過VEGF-A/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑實(shí)現(xiàn)對心臟纖維化的抑制[12]。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)，丹參酮可以上調(diào)CF中miR-29b的表達(dá)，抑制TGF-β信號(hào)通路，并下調(diào)Col-1、Col-3和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)。而經(jīng)Smad3 的小干擾RNA(siRNA)處理的CF會(huì)顯著抑制miR-29b的表達(dá)，阻礙丹參酮的抗纖維化作用。這表明抑制TGF-β/Smad3通路是miR-29b抗纖維化的機(jī)制。另外，miR-29b還靶向影響膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶、胰島素樣生長因子-1和穿透素-3等參與纖維化的蛋白分泌，發(fā)揮抗纖維化作用[14]。關(guān)于miR-29c的抗纖維化作用，Liu等[15]發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-29c表達(dá),可抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌損傷和纖維化，此過程中miR-29c調(diào)控的靶基因包括膠原蛋白家族、纖連蛋白1和TGF-β。Lew等[16]發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)心肌梗死后，miR-29c對心臟纖維化的作用與TGF-β并不相干，而與促進(jìn)NADPH氧化酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1的表達(dá)有關(guān)，這可能是miR-29c調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)心臟纖維化的獨(dú)特機(jī)制。

Wang等[17-18]分別在容量超負(fù)荷心力衰竭模型和急性心肌梗死模型中證實(shí)，miR-208a通過增加內(nèi)皮因子表達(dá)誘導(dǎo)了心肌纖維化。Zhou等[19]的研究中，上調(diào)miR-208b水平可以顯著改善心肌梗死后的心臟功能，并抑制Col-1和α-SMA表達(dá)(P<0.01)。熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA4是miR-208b直接的靶點(diǎn)，miR-208b通過抑制GATA4，下調(diào)Col-1和α-SMA發(fā)揮抗纖維化作用。

Sun等[20]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)異丙腎上腺素處理的CF中miR-214的表達(dá)會(huì)抑制ERK1/2-MAPK信號(hào)，延緩CF增殖和膠原分泌。線粒體融合蛋白2被認(rèn)為是miR-214的直接作用靶點(diǎn)，miR-214通過抑制線粒體融合蛋白2表達(dá)和活化ERK1/2-MAPK信號(hào)介導(dǎo)調(diào)節(jié)CF增殖和膠原分泌。Dong等[21]的研究中，上調(diào)miR-214能減緩血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)或心肌梗死后出現(xiàn)的心臟纖維化，并降低膠原聚集、TGF-β1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達(dá)。表明miR-214通過調(diào)節(jié)TGF-β1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1等因子表達(dá)，抑制纖維化而具有心臟保護(hù)作用。

研究還發(fā)現(xiàn)，miR-18a-5p通過抑制Notch信號(hào)通路，調(diào)控高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕糖尿病心肌病心肌纖維化程度[22]。Wei等[23]證實(shí)miR-26a過表達(dá)能抑制核因子-κB活性，減弱Col-1和結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化作用。此外， miR-15[24]、miR-98[25]等也通過抑制TGF-β1信號(hào)，發(fā)揮抗心肌肥厚和纖維化作用。而miR-34a、miR-155[26]等卻會(huì)增加TGF-β1在CF中的致纖維化活性[27]。其中，靶向影響Smad4表達(dá)是miR-34a促纖維化的基礎(chǔ)。miR-155對TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的調(diào)控具有特異性，其他Smad不受miR-155調(diào)控。

3 miRNA成為心肌纖維化治療靶點(diǎn)

多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，通過下調(diào)miRNA表達(dá)、干擾正常miRNA的功能，或是借助模擬物增強(qiáng)miRNA對靶基因的作用效果，心肌纖維化的程度與心功能可得到一定改善[28-29]。 因此，將miRNA作為治療靶標(biāo)，通過人工調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)，有望成為抗心肌纖維化治療極具潛力的新策略。

目前，基于miRNA的抗心肌纖維化治療尚存在諸多有待解決的問題。例如單個(gè)miRNA可以作用于不同器官中的多個(gè)靶基因，而同一個(gè)靶基因也會(huì)受到不同miRNA的調(diào)控，即miRNA表達(dá)大多不具備器官和組織特異性，這使得調(diào)控miRNA治療纖維化較為復(fù)雜，且存在“脫靶”效應(yīng)等局限。因此，在該方法應(yīng)用于治療心肌纖維化和心臟重構(gòu)之前，理解相關(guān)miRNA參與心肌纖維化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而實(shí)現(xiàn)局部靶向治療相當(dāng)重要。另外，miRNA模擬物是與前體miRNA類似的雙鏈復(fù)合體，其缺點(diǎn)主要是細(xì)胞攝取雙鏈RNA的能力有限，以及RNA模擬物必須要被合并到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中才能實(shí)現(xiàn)生物學(xué)活性，而RNA模擬物一旦過度表達(dá)則會(huì)造成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體飽和，對內(nèi)源性miRNA正常的生理功能形成干擾[30]。

總之，miRNA在心臟纖維化中的調(diào)控作用還未明了，而基于miRNA的抗心肌纖維化治療也缺乏臨床證據(jù)支持。就靶向治療而言，目前miRNA局部傳輸釋放系統(tǒng)(如釋放miRNA的可降解支架以及囊泡包裝的miRNA等)的研發(fā)已取得了顯著的進(jìn)展。另外，促融合脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)和兩性脂質(zhì)復(fù)合體等輔助分子，也被用來改善miRNA傳輸?shù)男屎徒M織特異性。這些技術(shù)都為通過調(diào)節(jié)體內(nèi)miRNA水平從而預(yù)防和治療心肌纖維化提供了巨大前景。

4 展望

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，miRNA在心肌纖維化等心血管領(lǐng)域中的作用被越來越多地發(fā)現(xiàn)。通過調(diào)控miRNA實(shí)現(xiàn)對心肌纖維化的治療，將從基因水平上抑制心肌纖維化，從而改善患者的預(yù)后。有理由相信隨著研究的深入，有望實(shí)現(xiàn)心肌纖維化治療革命性的突破。