從熱敏通道TRPV1探討蛇床子提取物的作用機(jī)制?

安致君，劉珍洪，于 崢，汪文來(lái)，陶旭光，高 蔚，郭 蓉，殷 茵， 韓雪珍，吳丹桐，趙凱維， ，趙紅霞Δ，楊 楨Δ

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029； 2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3. 美國(guó)德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心綜合生物學(xué)及藥理學(xué)系，休斯頓)

蛇床子最早收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有數(shù)千年的醫(yī)療實(shí)踐應(yīng)用，別名野茴香、野胡荽，為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，具有濃郁的芳香氣息。其性味辛、苦、溫，具有溫腎壯陽(yáng)、殺蟲止癢的功效[1]，臨床上用來(lái)治療陰部瘙癢、痹癥、濕疹、陽(yáng)痿、宮寒不孕等。熱敏通道(TRPV1、TRPA1和TRPM8等)是自然界許多芳香物質(zhì)的分子靶點(diǎn)，它與溫?zé)岣杏嘘P(guān)，也與瘙癢和疼痛密切相關(guān)。許多辛味中藥如生姜(辛、微溫)、吳茱萸(辛、苦，熱)、蔥白(辛、溫)、羌活(辛、苦，溫)等含有TRPV1的激動(dòng)劑[2-3]，部分TRPV1/A1/M8的激動(dòng)劑已經(jīng)在蛇床子中存在。蛇床子部分藥效的發(fā)揮可能是作用于熱敏通道TRPV1路徑實(shí)現(xiàn)的。本研究以蛇床子提取物(水提和醇提)為研究對(duì)象，結(jié)合電生理膜片鉗技術(shù)，在瞬轉(zhuǎn)了人TRPV1的HEK293細(xì)胞上測(cè)試其能否活化或抑制TRPV1，以探討蛇床子發(fā)揮藥效作用的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

中藥蛇床子(北京同仁堂東四藥店)，TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)，質(zhì)粒GFP(北京愛(ài)思益普)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calciumchloride(Sigma)。

1.2 儀器

300克密封型搖擺式粉碎XL-06B(廣州旭朗)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海虹昕)、數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(常州潤(rùn)華)、SHZIII型循環(huán)水真空泵(上海亞榮)、EPC-10 Quattro膜片鉗放大器(Heka)、PatchMaster數(shù)據(jù)獲取軟件(Heka)、P-97拉制儀器(Sutter Instruments)、IGOR-Pro分析軟件(WaveMetrics Inc)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 蛇床子提取物制備 水提物制備：用電子秤量得50 g蛇床子，倒入400 ml雙蒸水浸泡30 min，加熱至沸騰30 min后倒出藥汁，剩余的藥渣加250 ml雙蒸水第二次煎煮，合并2次藥汁，雙層濾紙過(guò)濾，99℃恒溫水浴鍋加熱濃縮調(diào)濃度為1 g/ml，3500 r/min離心15 min后取上液即得蛇床子水提物，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

醇提物制備：秤量80 g蛇床子，粉碎后加入640 ml的75%乙醇浸泡30 min，轉(zhuǎn)移入回流提取器中于95℃恒溫水浴鍋上回流提取2 h，收集藥液過(guò)濾，剩余的藥渣再倒入400 ml乙醇繼續(xù)回流1 h，2次所提濾液傾入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上回收乙醇，所得提取物(膏狀物不含乙醇)用雙蒸水調(diào)濃度至1 g(生藥)/ml。以上提取物均分裝后保存于-20℃低溫冰箱備用。

1.3.2 電生理膜片鉗實(shí)驗(yàn) 參照前期實(shí)驗(yàn)論文方法[3]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效應(yīng)研究

圖1顯示，蛇床子水提物稀釋成5 mg(生藥)/ml，測(cè)試其對(duì)表達(dá)hTRPV1/ HEK293細(xì)胞跨膜電流的作用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，先滴入細(xì)胞外液作為陰性對(duì)照，觀察電流的基線水平，然后滴加測(cè)試樣品，電流到達(dá)峰值并開(kāi)始下降后用細(xì)胞外液洗脫(washout)，最后施加陽(yáng)性藥30 μM辣椒素檢驗(yàn)所記錄細(xì)胞是否成功轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞外液(Pre)比較，蛇床子水提物使hTRPV1/ HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的跨膜電流，蛇床子水提物滴加入空轉(zhuǎn)的HEK293細(xì)胞中不產(chǎn)生跨膜電流(數(shù)據(jù)不顯示)。

注： 左圖：各組+100 mV電壓下電流峰值對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖右圖：+100 mV電壓下跨膜電流時(shí)程圖，其中小圖為在細(xì)胞外液(a)、蛇床子提取物峰值(b)、辣椒素峰值(c)點(diǎn)用電壓斜坡(voltage ramp)檢測(cè)到的I-V關(guān)系曲線。**P<0.01，表示組間差異顯著，n=6圖1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效應(yīng)研究

2.2 蛇床子乙醇提取物量效研究

圖2顯示，將蛇床子醇提物給予細(xì)胞外液稀釋成3 mg/ml和10 mg/ml，測(cè)試這2個(gè)濃度的蛇床子醇提物對(duì)表達(dá)hTRPV1的HEK293細(xì)胞跨膜電流的影響。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞外液(Pre)比較，蛇床子醇提物3 mg/ml、10 mg/ml這2個(gè)濃度均可使細(xì)胞產(chǎn)生跨膜電流(P<0.01)，且3 mg/ml、10 mg/ml這2個(gè)濃度產(chǎn)生的跨膜電流無(wú)顯著差異。

注：左圖：各組+100 mV電壓下電流峰值對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖右圖：+100 mV電壓下跨膜電流時(shí)程圖** P<0.01，表示組間差異顯著，n=6圖2 蛇床子醇提物對(duì)轉(zhuǎn)染hTRPV1的HEK293細(xì)胞全細(xì)胞電流影響

2.3 結(jié)論

蛇床子的水提物和醇提物都激活TRPV1通道產(chǎn)生跨膜電流。蛇床子的辛溫之性很可能是TRPV1活化的結(jié)果，而TRPV1與瘙癢與疼痛的關(guān)系可以幫助我們很好地理解蛇床子的相關(guān)功效。

3 討論

《神農(nóng)本草經(jīng)》將蛇床子列為上品，概述其性味功效：“味苦，平。主婦人陰中腫痛，男子陽(yáng)痿、濕癢，除痹氣，利關(guān)節(jié)，癲癇惡創(chuàng)(瘡)?！逼浜蟛痪玫摹侗静萁?jīng)集注》(草木上品)記載為“味苦、辛、甘，平，無(wú)毒。主治婦人陰中腫痛，男子陰痿濕癢，除痹氣，利關(guān)節(jié)，癲癇，惡瘡。溫中下氣，令婦人子臟熱，男子陰強(qiáng)?！薄督饏T要略·婦人雜病脈證并治》：“婦人陰寒，溫中坐藥，蛇床子散主之……綿裹內(nèi)之，自然溫。”《備急千金要方·雜治第十七》曰：“治產(chǎn)后陰下脫方：蛇床子一升，布裹炙熨之。亦治產(chǎn)后陰中痛。”又有外治方：“治男女陰中瘡濕癢方(黃連、梔子、甘草、黃柏、蛇床子)……為細(xì)末，以粉瘡上……深者，用綿裹納瘡中?！爆F(xiàn)代《中藥學(xué)》將其應(yīng)用概括為：“陰部濕癢，濕疹，疥癬；寒濕帶下，濕痹腰痛；腎虛陽(yáng)痿，宮冷不孕”，既可內(nèi)服又可外用?，F(xiàn)代研究[4-5]顯示，蛇床子具有抗菌、止癢、止痛、防治骨質(zhì)疏松、保護(hù)心血管、抗血栓、鎮(zhèn)靜催眠等作用。

從分子方面理解蛇床子的功效有重要意義。近來(lái)，隨著熱敏通道的發(fā)現(xiàn)以及部分結(jié)構(gòu)和作用的揭示，使得對(duì)蛇床子的部分功效和主治可以得到進(jìn)一步的理解。熱敏通道是感受寒熱的一類生命攸關(guān)的蛋白質(zhì)，在機(jī)械和熱傳導(dǎo)、皮膚穩(wěn)態(tài)、味覺(jué)、腎、內(nèi)分泌、呼吸道、免疫、心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生育和衰老方面都發(fā)揮作用。它們大量的分布在外周感覺(jué)神經(jīng)上，以感知內(nèi)外環(huán)境的溫度、化學(xué)、機(jī)械等傷害性刺激，與寒熱、疼痛和瘙癢等感覺(jué)有著重要關(guān)聯(lián)[6]。

3.1 蛇床子的化學(xué)成分

蛇床子的化學(xué)成分主要有香豆素類和揮發(fā)油類以及其他微量元素[4]，而具有生物活性的香豆素類化合物含量最高[7]。蛇床子所含歐前胡素(imperatorin)、蛇床子素(osthole)是TRPV1的激動(dòng)劑[8-9]，其揮發(fā)油所含成分檸檬烯能激活另一個(gè)熱敏通道TRPA1[10]。

3.2 蛇床子的溫?zé)岣信c止痛作用

外周神經(jīng)調(diào)節(jié)陰道的平滑肌張力、血流量和疼痛敏感性，而子宮表達(dá)TRPV1、TRPA1的神經(jīng)隨著性激素水平的生理波動(dòng)，如懷孕、分娩、性周期和青春期時(shí)產(chǎn)生巨大改變，局部性激素也參與其間[11-12]。這些部位的疼痛與局部神經(jīng)重塑有關(guān)，外陰痛的特征是在外陰前庭區(qū)域有痛苦的燒灼感，異常性疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏，局部上皮內(nèi)和乳突的神經(jīng)支配，其間的TRPV1表達(dá)大量增加[13]。

蛇床子對(duì)外陰和盆腔的疼痛均有良好效果，蛇床子的全身或局部運(yùn)用會(huì)活化TRPV1受體產(chǎn)生溫?zé)岣?，這應(yīng)該是蛇床子外用“綿裹內(nèi)之，自然溫”的分子基礎(chǔ)，如同辣椒或大蒜。陰道內(nèi)使用蛇床子除產(chǎn)生溫?zé)岣袑?duì)宮寒發(fā)揮治療作用外，還會(huì)由TRPV1/TRPA1介導(dǎo)，通過(guò)神經(jīng)交叉脫敏對(duì)多種因素如膀胱炎、前列腺炎、結(jié)腸炎或腰肌勞損等引起的盆腔疼痛發(fā)揮止痛作用[14]。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明，蛇床子素能夠顯著減少醋酸致痛小鼠的扭體次數(shù)和升高熱致痛小鼠的痛閾，對(duì)物理和化學(xué)引起的疼痛和炎癥均有明顯的對(duì)抗作用[4]。

3.3 蛇床子的止癢作用

瘙癢和疼痛是密切相關(guān)但截然不同的感覺(jué)，其源頭均在感覺(jué)神經(jīng)的皮膚末梢，它們共享大部分重疊的介質(zhì)和受體，瘙癢反應(yīng)的神經(jīng)元對(duì)疼痛刺激也很敏感，瘙癢的復(fù)雜機(jī)制目前并不清楚。疼痛刺激可引起一些慢性病(如特應(yīng)性皮炎)的瘙癢，一些治療慢性疼痛的藥物對(duì)慢性瘙癢也有效，TRPV1的活化對(duì)瘙癢通道有抑制作用[15]。實(shí)驗(yàn)證明，適當(dāng)濃度的蛇床子素可通過(guò)調(diào)控TRPV1離子通道的活性抑制組胺依賴性癢[8]。

3.4 蛇床子的其他作用

古人用蛇床子治療癲癇。長(zhǎng)期以來(lái)，認(rèn)為海馬神經(jīng)元中的鈣離子累積是癲癇的主要發(fā)病因素。TRPV1是海馬中鈣透性通道和癲癇的介質(zhì)，TRPV1在癲癇腦區(qū)如海馬CA1區(qū)和齒狀回中表達(dá)，表明在海馬體中抑制TRPV1可能是一個(gè)預(yù)防癲癇發(fā)作的靶點(diǎn)[16]。因此，依古籍記載蛇床子可能會(huì)作用于大腦，這需要證實(shí)其有效成分可以穿過(guò)血腦屏障。蛇床子素通過(guò)血腦屏障的證據(jù)是確定的[17]。蛇床子的抗癲癇作用可能不是以TRPV1為惟一作用靶點(diǎn)，其所含總香豆素可以作用于GABAA受體[18]，該受體在癲癇發(fā)作中有重要意義。而這二者之間，TRPV1的活性可以被GABA受體抑制[19]，可能有助于抑制癲癇的發(fā)作?？梢?jiàn)，蛇床子抗癲癇在同一信號(hào)通路中的作用是多靶點(diǎn)的。

蛇床子對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響還包括改善學(xué)習(xí)記憶、抗帕金森、鎮(zhèn)靜催眠等作用[17]，對(duì)于蛇床子的研究顯示出有性激素樣作用。性激素在不同的感覺(jué)細(xì)胞中發(fā)揮多效性作用，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的再生具有重要的功能。性激素的減少與認(rèn)知和心理健康受損以及神經(jīng)病變性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，恢復(fù)神經(jīng)-內(nèi)分泌軸的關(guān)鍵在于老化過(guò)程中可通過(guò)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生在部分區(qū)域，雌激素依賴性瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道TRPV1，能夠介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)生成以及受損神經(jīng)再生，TRPV1激動(dòng)劑可調(diào)節(jié)被敏化神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)與修復(fù)[20]，而調(diào)節(jié)劑作為其他認(rèn)知增強(qiáng)劑，可提高神經(jīng)干細(xì)胞祖細(xì)胞在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的存活率、分化和整合能力[21]。

精子生成依賴睪丸的酸性微環(huán)境，Sertoli細(xì)胞為調(diào)控和維持精子發(fā)生提供了一個(gè)受控的微環(huán)境，其中酸性環(huán)境對(duì)男性生育力至關(guān)重要。它是由酸敏氯離子通道(ASCC)調(diào)節(jié)，而TRPV1是其調(diào)控因子[21]。精子運(yùn)動(dòng)到受精地點(diǎn)是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，這與精子有趨熱性有關(guān)，即精子具有溫度導(dǎo)向的運(yùn)動(dòng)，這樣才能與卵子結(jié)合而受孕。熱敏通道TRPV1是溫度傳感器，是精子趨熱運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)[22]。這些研究對(duì)蛇床子在陰道的使用、產(chǎn)生溫?zé)岣屑爸委煂m寒不孕有重要意義。

蛇床子性溫味辛，是自然界的香草，有典型的熱敏通道配體的特征。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，并部分闡明了該藥的分子意義。