基于1H-NMR的干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠肝組織代謝變化研究?

巴哈古力·阿卜都熱合曼，米熱阿依·亞力昆，太力艾提·吐爾洪， 迪那拉·恰熱甫汗，巴吐爾·買買提明

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011； 3. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 830011)

維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，體液是由肝臟轉(zhuǎn)化而成的復(fù)雜物質(zhì)，若體液平衡遭破壞會發(fā)生各種病理生理變化。干寒環(huán)境的影響和干寒屬性飲食的長期作用，會使體液平衡失調(diào)，并導(dǎo)致干寒性氣質(zhì)失調(diào)證，從而引發(fā)多種復(fù)雜性疾病[1]。

本研究以病證結(jié)合的干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病SD大鼠為研究對象，采用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行大鼠肝臟組織代謝物成分輪廓分析，闡述干寒性氣質(zhì)失調(diào)證以及干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠肝臟組織代謝變化特點，尋找與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在特異性代謝標(biāo)志物及其變化機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SPF級SD大鼠28只，體質(zhì)量(200±30 g)，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心(動物生產(chǎn)許可證號SCXK (新) 2011-0004)。動物實驗程序由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審批確認(rèn)，符合動物倫理學(xué)要求和實驗動物保護(hù)的相關(guān)規(guī)定(批準(zhǔn)號IACUC-20140304001)。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素(STZ)、戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉，上海山浦化工有限公司，分析純；膽酸鈉、膽固醇上海藍(lán)季生物有限公司；甲醇，天津市富宇化工精細(xì)化有限公司，分析純；3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸鈉(DSS)緩沖液，武漢安隆科訊技術(shù)有限公司；3 kDa超濾管，美國Millipore公司；5 mm 核磁管，美國Wilmad Lab Glass公司；超純水 Milli-Q系統(tǒng)，美國Millipore公司；RXZ-436 A人工氣候箱，寧波江南儀器廠；血糖儀，美國強生公司；600 MHz 核磁共振波譜儀，美國Varian 公司。

2 方法

2.1 模型的分組與制備

2.1.1 分組 干寒性氣質(zhì)失調(diào)證動物模型的制備：將SD大鼠置于SPF級實驗室，室溫(25±3)℃，相對濕度40%～60%，自由飲食，從6∶00AM至6∶00PM提供光線。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為健康對照組(11只)、干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組(9只)、干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組(8只)。

2.1.2 模型的制備 干寒飼養(yǎng)環(huán)境(6±1℃，相對濕度40%±7%)中采用干寒屬性飼料飼養(yǎng)21 d，建立干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠模型。在已經(jīng)建立的干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠模型的基礎(chǔ)上，用高糖高脂飼料穩(wěn)定飼養(yǎng)6周誘發(fā)胰島素抵抗。6周后按照大鼠體質(zhì)量腹腔注射STZ 40 mg/kg，注射72 h后測空腹血糖。72 h后的空腹血糖≥16.1 mmol/L就可以停止注射STZ。

2.2 肝臟樣本處理及核磁共振氫譜(1H-NMR)測定

2.2.1 樣本的處理 造模完成后，將大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液0.3 ml/100 g體質(zhì)量麻醉。解剖取新鮮肝臟組織分為2份，1份放入凍存盒液氮冷凍，隨后移至-80℃冰箱待NMR檢測，另1份用4%甲醛溶液固定、包埋、HE染色，用于組織病理形態(tài)學(xué)觀察。

2.2.21H-NMR測定1H-NMR檢測時，取凍存的肝組織同一部位約500～700 mg于2ml離心管中，加甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶1)1 ml，用組織破碎機制備勻漿，以12000 r/min離心15 min取上清液，重復(fù)3次，合并上清液并進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥粉用超純水1 ml進(jìn)行復(fù)溶，以12000 r/min離心15 min，取上清并用3 kDa超濾管過濾，取450 μL濾液與50 μL DSS緩沖液加入至5 mm核磁管中，用Inova600型核磁共振波譜儀調(diào)用NOESYPRESAT1D脈沖序列進(jìn)行1H-NMR譜的檢測。對部分樣本進(jìn)行二維核磁共振圖譜的檢測，包括1H-1H同核相關(guān)譜(1H-1H Homo nuclear Correlation Spectroscopy，1H-1H COSY)、質(zhì)子全相關(guān)譜(Total Correlation Spectroscopy，TOCSY)、J-分解譜(J-Resolved Spectroscopic，J-RES)等用于圖譜中各種峰的指認(rèn)。

2.3 圖譜處理

2.3.1 圖譜處理 采用MestReNova軟件對所有圖譜進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正，并用增寬因子0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行處理，以DSS分子內(nèi)(CH3)3的信號設(shè)為0.000 ppm進(jìn)行定標(biāo)。每一個1H-NMR譜在化學(xué)位移9.0～0.01 ppm范圍內(nèi)，以每段0.003 ppm進(jìn)行分段積分并進(jìn)行歸一化處理，同時移除5.20～4.70 ppm范圍內(nèi)的水分信號。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

1H-NMR譜的積分?jǐn)?shù)據(jù)采用SIMCA-P軟件進(jìn)行偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)，觀察3組之間差異，并通過200次的排列驗證試驗對PLS 模型進(jìn)行外部驗證(Permutation test)，以便判斷其有效性。根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測(Pearson’s product moment correlation coefficient)及最小樣本量確定樣本中代謝物含量在不同組別之間的顯著性閾值定為r=0.51，|r|>0.51，則對應(yīng)代謝物在2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，|r|值越大表示差異性越大反之越小。血糖值的差異性采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 空腹血糖測定結(jié)果

表1顯示，與正常組比較，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組血糖無顯著性變化，而干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 空腹血糖值比較

注：與正常組比較:*P<0.05

3.2 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

圖1顯示，與健康對照組比較，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組大鼠肝細(xì)胞點狀壞死、瘀血，有不同程度的水腫(圖1B)；干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠呈現(xiàn)重度水腫、瘀血，并出現(xiàn)肝細(xì)胞空泡變性和脂肪變性(圖1C)。

3.3 肝組織1H-NMR圖譜分析

圖2～4顯示，3組大鼠肝組織典型1H-NMR譜。對1H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析結(jié)果顯示，健康對照組、干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組和干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組肝組織代謝成分有明顯的差異，外部驗證分析參數(shù)為R2=(0.0，0.268)，Q2=(0.0，-0.325)，顯示PLS模型有效。健康對照組與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證模型組大鼠相比較的OPLS-DA分析結(jié)果顯示，分析模型的R2X=0.45，Q2=0.68，說明OPLS-DA分析模型得到較好的分離，2組的代謝差異性，同時有較好的預(yù)測能力(圖4 A)。健康對照組與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組OPLS-DA分析的參數(shù)分別是R2X=0.39,Q2=0.67，同樣說明分析結(jié)果有較高的可靠性(圖4B)。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×400)

注:A為健康對照組，B為干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組，C為干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組。圖2 大鼠肝組織典型1H-NMR譜

圖3 健康對照組(■)、干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組(●)以及干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組(▲)大鼠肝組織樣本1H-NMR譜PLS-DA分析得分圖(A)與排列驗證試驗結(jié)果(B)

注：A.健康對照組(■)與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組(●)比較；B.健康對照組(■)與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組(▲)比較圖4 OPLS-DA分析的得分圖

表2顯示，與健康對照組比較，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組大鼠肝組織中β-羥基丁酸、肌酸、氧化三甲胺、蘇氨酸和膽堿等代謝物含量明顯升高，乳酸、肌酸肝、葡萄糖和肌醇等代謝物含量明顯降低；干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠肝組織中β-羥基丁酸、肌酸、肌醇和葡萄糖等代謝物含量明顯升高，異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、α-酮戊二酸、乙酰天冬氨酸、甲胺、肌氨酸、肌酸肝、組氨酸、色氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、膽堿、酪氨酸、苯丙氨酸、煙酸和馬尿酸等代謝物含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 討論

維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體攝入的各種營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)消化分解、肝臟吸收轉(zhuǎn)化等代謝途徑進(jìn)入全身血液循環(huán)中，再通過血液循環(huán)到達(dá)人體各個部位，經(jīng)細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化最終成為人體所需成分[1]，可見肝臟在體液的生成及平衡過程中起非常重要的作用。本研究采用代謝組學(xué)研究手段，對大鼠肝臟組織在證和病證結(jié)合狀態(tài)下的代謝組學(xué)進(jìn)行分析，揭示干寒性氣質(zhì)失調(diào)證發(fā)生發(fā)展過程的基本機制。結(jié)果顯示，大鼠模型在干寒性氣質(zhì)失調(diào)證及干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病狀態(tài)下其肝臟組織發(fā)生了多種代謝通路的變化。

表2 模型組大鼠與健康對照組肝臟組織中差異性代謝物及其相關(guān)系數(shù)比較(r)

注： s為單峰，d 為雙重峰，t 為三重峰，q 為四重峰，m 為多重峰，dd 為雙重峰

糖代謝結(jié)果顯示，與健康對照組比較，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠肝臟組織中葡萄糖和乳酸水平明顯降低； Kuwahata等[2]報道“肝細(xì)胞損傷后，血胰島素的增多和糖代謝的改變使得葡萄糖水平降低”，可見干寒性氣質(zhì)失調(diào)證的發(fā)生與肝臟功能的異常有一定的相關(guān)性。而干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組大鼠肝臟組織乳酸含量的明顯降低，與糖尿病時胰島素抵抗、糖代謝受到抑制等因素相關(guān)。

氨基酸代謝顯示，肝臟富含氨基酸代謝酶類，為氨基酸合成、分解的主要的場所。干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠肝臟中只有蘇氨酸含量明顯升高，但是其他氨基酸含量未發(fā)生明顯變化。蘇氨酸有一定程度的促進(jìn)脂肪代謝的作用，也是一種生糖氨基酸，其在干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠肝臟中的含量變化與能量代謝的異常密切相關(guān)。2型糖尿病大鼠血糖利用不足、蛋白質(zhì)分解代謝增強而合成代謝減弱，氨基酸消耗增加導(dǎo)致其含量明顯降低[3]。干寒性氣質(zhì)失調(diào)證由于干寒環(huán)境、飲食、精神刺激影響肝臟功能，從而改變體液分布[1]；從證到病的過程中，肝細(xì)胞氨基酸代謝發(fā)生明顯異常，肝臟功能受損，這與肝組織病理切片形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。苯丙氨酸和酪氨酸均在肝臟中進(jìn)行分解代謝芳香族氨基酸，而芳香族氨基酸代謝紊亂常見于肝損傷[4-5]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組大鼠肝臟中酪氨酸和苯丙氨酸水平未發(fā)生變化，但是干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組大鼠肝臟組織中這2種氨基酸水平明顯降低。維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疾病發(fā)生過程中首先體內(nèi)體外多種因素影響下體液平衡被破壞并發(fā)展為“病”。干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組大鼠雖未出現(xiàn)較嚴(yán)重的肝臟損傷，但是發(fā)展為糖尿病時就出現(xiàn)了較明顯的損傷。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的代謝也與胰島素水平密切相關(guān)，而肝損傷會導(dǎo)致直鏈氨基酸水平的異常[6]。實驗結(jié)果顯示，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠伴有較明顯的肝損傷，病理切片形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也證明了這一點。谷氨酰胺作為生糖氨基酸，是肝臟捕捉氨的重要載體和最終產(chǎn)物，也是三羧酸(TCA)循環(huán)的中心環(huán)節(jié)，其含量的變化直接影響三羧酸循環(huán)，最終使能量代謝異常。

脂代謝顯示，脂肪酸和甘油進(jìn)入肝臟后的代謝產(chǎn)物是酮體。酮體中β-羥基丁酸占78%，乙酰乙酸占20%，丙酮占2 %[7]。研究結(jié)果顯示，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證組和干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病組均出現(xiàn)β-羥基丁酸顯著升高，說明2組模型組均發(fā)生肝線粒體脂代謝加強，體內(nèi)脂肪動員增加。這可能與干寒性氣質(zhì)失調(diào)證的干寒、精神刺激等不良環(huán)境因素相適應(yīng)，因此出現(xiàn)能量供應(yīng)上調(diào)。另外肌酸是由其前提物質(zhì)甲硫氨酸提供甲基，主要在肝臟合成后轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峒∷醿Υ婺芰?，認(rèn)為是評價肝損傷的重要參數(shù)指標(biāo)[8]。文獻(xiàn)報道，四氯化碳肝中毒實驗中發(fā)現(xiàn)，肌酸含量升高[9]。本研究中2組模型組大鼠肝臟組織中肌酸相對均顯著升高，說明存在肝臟功能受損，可見肝功能慢性病變是干寒性氣質(zhì)失調(diào)證發(fā)生并最終演變?yōu)閺?fù)雜性疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)。

肌酸酐是肌酸分解代謝產(chǎn)物，并由腎臟排出體外，是評價腎小球濾過率的指標(biāo)[10]，肌酸/肌酸酐水平的上升與腎臟病變有密切聯(lián)系[11]。本研究結(jié)果顯示，肌酸/ 肌酸酐水平改變在2組肝組織中的表現(xiàn)一致，預(yù)示大鼠腎臟發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。

膽堿類物是細(xì)胞膜的主要組成成分，其相對含量的增加表明細(xì)胞膜完整性下降，上皮細(xì)胞受損[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證大鼠出現(xiàn)膽堿含量升高，而干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病大鼠膽堿含量下降，說明2組細(xì)胞膜合成和調(diào)節(jié)都出現(xiàn)異常。

馬尿酸含量的變化與腸道菌群活性和成分有關(guān)[13]，也與腸道菌群功能有密切相關(guān)[14]。氧化三甲胺在腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)換為三甲胺[15]，其代謝過程的變化也與腸道菌群的平衡密切相關(guān)?？梢?，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證的發(fā)生發(fā)展可能與伴隨腸道菌群平衡的異常有關(guān)。

綜上所述，干寒性氣質(zhì)失調(diào)證的發(fā)生發(fā)展并最終出現(xiàn)干寒性氣質(zhì)失調(diào)證糖尿病過程中伴隨有肝臟和腎臟功能的異常，出現(xiàn)糖代謝紊亂、細(xì)胞膜的完整性降低、上皮細(xì)胞受到傷害、能量代謝異常、三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物代謝紊亂、ATP儲存下降和腸道菌群失衡，最終導(dǎo)致體液分布紊亂等多種生理功能的異常。