濱海不同濕地類型土壤微生物功能多樣性

顧國海， 李夢莎

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008； 2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040)

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一[1]，是土壤元素循環(huán)與轉(zhuǎn)化的主要?jiǎng)恿χ籟2-3]，在生態(tài)系統(tǒng)功能以及全球生態(tài)系統(tǒng)地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。土壤微生物群落多樣性反映了土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化[6]，而通過對土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，能夠?yàn)榻鉀Q生態(tài)系統(tǒng)功能的變化，制定保護(hù)和合理利用濕地資源的措施提供理論基礎(chǔ)[7-9]。因此，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能多樣性，對評價(jià)土壤質(zhì)量、生態(tài)系統(tǒng)功能和土壤元素循環(huán)具有重要意義[10-11]。

濱海濕地是我國重要的濕地之一，具有顯著的區(qū)域特性。本試驗(yàn)選擇3個(gè)典型的濕地類型-蘆葦濕地、堿蓬濕地、互花米草濕地分別設(shè)立樣地，采集表層0～20 cm的土壤，采用Biolog-ECO微平板檢測法分析土壤微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律，探討其差異的形成機(jī)制，以期全面了解和評價(jià)濱海濕地土壤微生物的分布特點(diǎn)。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明濱海不同類型濕地土壤微生物分布特征提供理論基礎(chǔ)，為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)樣地位于江蘇省鹽城國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)。總面積約為247 260 hm2，其中核心區(qū)面積22 596 hm2，緩沖區(qū)面積56 742 hm2，試驗(yàn)區(qū)面積167 922 hm2。保護(hù)區(qū)位于江蘇省鹽城市境內(nèi)，范圍在119°53′45″～121°18′12″E，32°48′47″～34°29′28″N 之間。保護(hù)區(qū)地處暖溫帶與北亞熱帶過渡地帶，主要受海洋與大陸性氣候影響，年平均氣溫為 13.7～14.6 ℃，年平均降水量1 000 mm，雨量集中在夏季，冬天多干旱。夏季(3月至8月份)涼爽，冬季(9月至次年2月)溫暖。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)站內(nèi)選擇3個(gè)20 m×20 m代表樣地，分別為蘆葦濕地(LW)、堿蓬濕地(JP)以及互花米草濕地(MC)。于2014年8月采集土壤樣品，用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采集0～20 cm土層，每個(gè)土樣由5個(gè)采集點(diǎn)的土壤混合，混勻后用四分法取適量于封口袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。采集的土樣一部分保存在4 ℃條件下，用于分析土壤微生物群落功能多樣性；另一部分風(fēng)干、磨細(xì)，過100目篩用于測定土壤理化性質(zhì)(表1)。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用Biolog-ECO微平板法對不同類型濱海濕地土壤微生物功能多樣性進(jìn)行分析。具體方法參照Classen等的方法[11]。首先土壤樣品在25 ℃活化24 h，稱取約10 g烘干土的新鮮土樣加入內(nèi)有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，加無菌棉花塞后，將三角瓶在旋渦振蕩器上震蕩1 min，然后置于冰水浴中1 min，反復(fù)3次。靜置2 min后按逐步稀釋法，依次稀釋為10-2和10-3的土壤懸浮液。用八通道移液器向ECO板每孔中加入10-3的土壤懸浮液，接種量為150 μL，將接種好的微孔板放在(25±1) ℃下連續(xù)培養(yǎng)13 d，每隔 24 h 用酶標(biāo)儀測定590 nm處的吸光度。

土壤pH值測定時(shí)水土比為2.5 mL ∶1 g；土壤含水率采用烘干法測定；土壤有機(jī)碳利用碳氮分析儀測定(耶拿-2100S， 德國耶拿分析儀器股份公司)； 土壤中全氮采用半微

表1 不同濕地類型下的土壤理化性質(zhì)

量凱氏定氮法測定；硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法測定；銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

微生物代謝強(qiáng)度采用平均顏色變化率(average well color development，簡稱AWCD)來描述，是利用單一碳源能力的重要指標(biāo)。采用Biolog微平板培養(yǎng)168 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，此時(shí)即使生長較慢的微生物也已參與碳源的代謝過程，因此能較全面地反映微生物群落的信息。采用Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性。

平均顏色變化率[12-14]：AWCD=∑(Ci-R)/31；

Shannon多樣性指數(shù)[15-16]：H=PilnPi；

Simpson多樣性指數(shù)[16]：D=1-∑(Pi)2；

式中：Ci為第i個(gè)碳源孔吸光度；R為對照孔吸光度，若Ci-R≤0，計(jì)為0；ni是第i孔的相對吸光度；Pi為ni與整個(gè)平板相對吸光度總和的比率。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為α=0.05；繪圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物對碳源利用的動(dòng)力學(xué)特征

從圖1可以看出，培養(yǎng)期間AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高，其中，24～168 h期間AWCD值快速增加，說明微生物不斷適應(yīng)ECO板各孔的環(huán)境，處于對數(shù)生長期，大量碳源被利用，此時(shí)微生物代謝活性旺盛；隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，168 h以后土壤微生物緩慢步入穩(wěn)定期。比較不同濕地類型土壤微生物群落AWCD發(fā)現(xiàn)，蘆葦濕地>堿蓬濕地>互花米草濕地，說明隨著陸-海濕地類型的改變土壤微生物碳代謝活性逐漸降低。

2.2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

土壤微生物群落對不同碳源的利用情況可以用多樣性指數(shù)表示。表2中顯示了土壤微生物在培養(yǎng)168 h時(shí)的Shannon、Simpson和McIntosh多樣性指數(shù)，可在數(shù)量特征上相對反映土壤微生物群落物種組成和個(gè)體數(shù)量分布的情況。結(jié)果顯示，在3個(gè)類型的濕地中，隨著由陸-海濕地類型的轉(zhuǎn)變，土壤微生物Shannon多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為下降趨勢。其中，蘆葦濕地的土壤微生物Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)均最高，堿蓬濕地次之，互花米草濕地最低，從Shannon指數(shù)來看，蘆葦濕地僅與堿蓬濕地差異顯著，而與互花米草濕地差異不顯著；從McIntosh指數(shù)來看，蘆葦濕地僅與互花米草濕地差異顯著，與堿蓬濕地差異不顯著。而不同類型濕地的Simpson指數(shù)間差異不顯著。

表2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)

2.3 土壤微生物群落對不同類型碳源的利用強(qiáng)度

Biolog-ECO板中含有31種碳源，包括碳水化合物類(10種)、氨基酸類(6種)、羧酸類(7種)、多聚物(4種)、酚酸類(2種)和胺類(2種)。由圖2可知，不同類型濕地土壤微生物群落對不同類型碳源的利用強(qiáng)度明顯不同，植被類型是影響不同碳源利用強(qiáng)度的重要因素。隨著濕地植被類型的變化，濱海濕地對不同類型碳源的利用強(qiáng)度呈現(xiàn)出不同的趨勢。其中，蘆葦濕地對于碳水化合物類、氨基酸類、多聚物的利用率最大；堿蓬濕地對碳水類利用率最大；互花米草濕地對多聚物類利用強(qiáng)度最大。整體來看，土壤微生物對碳水化合物類利用最多，其次是氨基酸類和多聚物，對羧酸類、酚酸類、胺類的利用則相對較少，可見濱海濕地土壤微生物比較偏好的碳源類型為碳水化合物類、氨基酸類和多聚物。

2.4 不同類型濕地土壤微生物群落功能主成分分析

對培養(yǎng)168 h的AWCD值進(jìn)行微生物群落功能主成分分析(principal component analysis，簡稱PCA)，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為82.18%和10.82%，累積方差貢獻(xiàn)率為93.00%，說明PC1和PC2是微生物群落碳源利用變異的主要來源，可以解釋變異的絕大部分信息。從圖3可以看出，不同類型濕地土壤微生物群落在碳源利用上有明顯的空間分異，而且在PC1和PC2上的得分系數(shù)均有明顯差異，可見土壤微生物群落碳代謝特征受到不同濕地類型的明顯影響。在PC2軸上，各樣地土壤微生物碳源利用的主成分分析得分排序?yàn)榛セ撞轁竦?堿蓬濕地>蘆葦濕地，與AWCD值和多樣性指數(shù)的分析結(jié)果一致，總體呈現(xiàn)隨不同濕地類型的改變碳源利用活性呈現(xiàn)下降的趨勢。不同類型濕地土壤微生物群落明顯分為3簇。

按照相關(guān)性系數(shù)絕對值大于0.85的標(biāo)準(zhǔn)對PC1和PC2進(jìn)行分析，從表3可以看出，與PC1具有較高相關(guān)性的碳源有13種，其中碳水化合物類6種、氨基酸類1種、羧酸類3種、多聚物1種、酚酸類2種；與PC2具有較高相關(guān)性的碳源有6種，包括碳水類1種、氨基酸類2種、羧酸類2種、胺類1種。綜合PC1和PC2結(jié)果可知，不同類型濕地中對土壤微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類，不同類型濕地的差異主要體現(xiàn)在對碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上，其中碳水化合物類最為突出。

2.5 土壤微生物代謝特性與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

將土壤有機(jī)碳含量、全氮含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量、含水率和pH值與土壤微生物群落多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由表4可知，Shannon多樣性指數(shù)與pH值呈正相關(guān)關(guān)系，而與有機(jī)碳含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Simpson多樣性指數(shù)與有機(jī)碳含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Mclntosh多樣性指數(shù)與全氮含量正相關(guān)；微生物的代謝活性(用AWCD表示)與pH值、有機(jī)碳含量和全氮含量正相關(guān)。

3 討論

土壤微生物群落多樣性是反映土壤肥力、土壤環(huán)境變化過程的重要指標(biāo)之一，可以很好地揭示不同生態(tài)系統(tǒng)在微生物上的功能差異，在生態(tài)系統(tǒng)功能中具有重要的意義。在本研究中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，AWCD值逐漸上升，且隨著蘆葦濕地-堿蓬濕地-互花米草濕地的變化，AWCD值呈現(xiàn)下降趨勢，這與鄭華等研究不同森林土壤微生物群落多樣性變化的結(jié)果一致[18]。說明土壤養(yǎng)分的差異是影響土壤微生物功能活性的主要因素之一。

Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)分別表征土壤中微生物群落的豐富度、優(yōu)勢度以及均勻度[6]。在3個(gè)不同濕地類型中，蘆葦濕地與堿蓬濕地Shannon多樣性指數(shù)差異顯著；蘆葦濕地與互花米草濕地McIntosh多樣性指數(shù)差異顯著。這說明土壤理化性質(zhì)影響了微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，這與很多研究的結(jié)果[19-20]一致。也就是說，土壤理化性質(zhì)對土壤微生物的活性以及結(jié)構(gòu)都具有重要的影響。

表3 31種碳源與PC1、PC2的相關(guān)系數(shù)

表4 土壤微生物多樣性指數(shù)與理化性質(zhì)的相關(guān)性

土壤微生物群落對不同類型碳源的利用強(qiáng)度存在一定的差異，3個(gè)不同濕地類型中，土壤微生物對碳水化合物類的利用率最高，為優(yōu)勢碳源，主要包括β-甲基-D-葡萄糖苷、D- 半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、D-木糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖；3個(gè)不同濕地類型微生物功能多樣性的差異主要體現(xiàn)在對碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上，這與左平等的研究結(jié)論[21]，即不同生境條件下土壤微生物對碳源的利用率有所不同，不同濕地土壤微生物功能上的差別是由各微生物群落對碳源的總體利用率產(chǎn)生的差別[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，互花米草濕地胺類的利用效率也占到了20%以上，且對碳源的利用率具有很強(qiáng)的選擇性，這都說明在淹水環(huán)境中土壤微生物的多樣性比較低，對碳源的利用具有選擇性；而蘆葦濕地和堿蓬濕地土壤微生物對碳源的利用率比較均衡。這說明土壤微生物所表現(xiàn)出的對碳源利用的不一致性是受到植物多樣性和土壤性質(zhì)的影響，受到多因素控制。

由土壤微生物對31種碳源的利用主成分分析得知，3個(gè)不同濕地類型的土壤微生物對碳源的利用特征差異比較明顯，這一點(diǎn)可能和樣地的生境特征有一定的關(guān)系。隨著濕地類型的變化，濕地的物種多樣性發(fā)生了變化，因此作為主要輸入碳源的凋落物的組成和含量發(fā)生了比較明顯的變化，進(jìn)而使土壤微生物代謝特征發(fā)生一定的改變，使其對碳源利用的種類和強(qiáng)度均發(fā)生變化。左平等指出，地上植物的多樣性會(huì)通過凋落物的差異對土壤微生物功能代謝產(chǎn)生重要影響[21-22]。此外，通過對土壤微生物的多樣性指數(shù)和AWCD值進(jìn)行主成分分析，3個(gè)不同濕地類型明顯出現(xiàn)分化，更有力地證明了濕地條件下物種多樣性的組成會(huì)對土壤微生物的組成和功能活性產(chǎn)生重要的影響。

綜上所述，不同類型濕地土壤微生物群落代謝特征具有較為明顯的地帶性差異。不同類型濕地由于其生境的差異，導(dǎo)致土壤理化以及植物群落組成發(fā)生了變化，這些是影響土壤微生物代謝活性的主要因素。由于Biolog-Eco微平板技術(shù)的局限性，僅采用此技術(shù)很難完整地反映不同濱海濕地土壤微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律。目前隨著其他技術(shù)手段的快速發(fā)展，結(jié)合多種微生物學(xué)研究方法，如磷酸脂肪酸(phospholipid fatty acid，簡稱PLFA)譜圖分析法和分子生物學(xué)技術(shù)(如宏基因組技術(shù))，將為完整了解鹽城濱海濕地微生物群落結(jié)構(gòu)和功能等信息提供很好的方法。