有機肥不同施肥量對茶園土壤微生物區(qū)系的影響

趙曉楠， 李玉紅， 蘆阿虔， 王 巖

(鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州 450001)

茶樹是多年生經(jīng)濟作物，喜酸聚鋁，因此茶園土壤比較特殊。為了提高茶葉產(chǎn)量，茶農(nóng)長期大量使用化肥，導(dǎo)致茶園土壤綜合肥力下降，茶園土壤生態(tài)遭到破壞。土壤是茶樹生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收的重要場所，是一個非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。施肥是影響土壤質(zhì)量及其可持續(xù)發(fā)展最重要的農(nóng)業(yè)措施之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，施肥技術(shù)在土壤肥力、土壤微生物及作物產(chǎn)量和品質(zhì)方面具有非常重要的影響，而土壤微生物在促進土壤有機質(zhì)分解、土壤礦質(zhì)營養(yǎng)循環(huán)、維持和提高土壤肥力等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。20世紀(jì)90年代以來，關(guān)于不同施肥方式對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響已有多人進行研究，但是前人對茶園土壤微生物的研究，受研究技術(shù)手段所限，大多數(shù)僅限于實驗室可培養(yǎng)微生物，基于分子生物學(xué)的研究尚不多見。由于環(huán)境中的微生物只有1%可用傳統(tǒng)平板計數(shù)法進行分離培養(yǎng)[2-3]，勢必會低估土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，無法對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成進行全面精準(zhǔn)的分析。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于分子生物學(xué)的土壤微生物的研究方法，如高通量測序技術(shù)解決了微生物不可培養(yǎng)的問題，能夠準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落的豐度和多樣性。因此，研究不同施肥制度下茶園土壤微生物區(qū)系的特征，可為茶園合理施肥和營造良好的茶樹生長環(huán)境提供理論支撐。

河南省信陽市是歷史名茶信陽毛尖的產(chǎn)地，其茶葉種植面積較大，但在茶葉生產(chǎn)過程中同樣存在片面追求產(chǎn)量而忽視土壤質(zhì)量的問題。鑒于此，筆者在河南省信陽市浉河區(qū)浉河港鎮(zhèn)的茶園進行大田試驗，研究有機肥不同施用量對茶園土壤性質(zhì)和土壤微生物區(qū)系的影響，以期通過合理的施肥措施，實現(xiàn)信陽市茶產(chǎn)業(yè)生態(tài)、可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取位于河南省信陽市浉河區(qū)浉河港鎮(zhèn)林場村八里坡組的茶園進行大田試驗，供試茶園的生境狀況如下：茶樹品種為福建大白茶7號，樹齡為16年，地理位置為32.026°N、113.849°E，面積為0.5 hm2，海拔為284.3 m，坡向為東坡，坡度為25°，前作為林地。分別于2012年12月、2013年12月和2014年12月進行有機肥表面撒施，茶園按當(dāng)?shù)亓?xí)慣進行田間管理，于每年清明節(jié)前采取土壤樣品進行相關(guān)測定。試驗設(shè)置3個處理：不施肥(CK)、施有機肥1 500 kg/hm2(T1)和施有機肥3 000 kg/hm2(T2)。試驗用有機肥養(yǎng)分含量標(biāo)準(zhǔn)：有機質(zhì)>45%，N+P2O5+K2O>7%。

1.2 樣品采集

連續(xù)施用有機肥3年后，采用五點取樣法對各處理試驗田進行土壤樣品采集。取0～20 cm土層的土壤，剔除土樣中較大的根和石子等雜物，之后將土樣中較大的土塊捏碎，混合均勻，然后采用四分法，將一部分裝入15 mL離心管中冷藏，用于土壤微生物分析；另一部分于托盤中自然風(fēng)干后磨細，過18、80目篩，用于土壤養(yǎng)分含量的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分含量測定方法 土壤pH值的測定采用SPM-10數(shù)字式pH計測定，堿解氮含量的測定采用堿解擴散法，土壤速效磷含量的測定采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法，土壤速效鉀含量的測定采用乙酸銨提取-火焰光度法，土壤有機質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀-油浴法[4]。

1.3.2 土壤微生物區(qū)系測定 土壤微生物區(qū)系采用高通量測序技術(shù)[5-6]，細菌以16S rDNA作為標(biāo)記基因，真菌以18S rDNA作為標(biāo)記基因，測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對茶園土壤養(yǎng)分含量的影響

從表1可以看出，施用有機肥可以提高土壤中有機質(zhì)、全氮、堿解氮和速效鉀含量，對土壤pH值和速效磷含量的影響不大。

表1 供試茶園的土壤養(yǎng)分含量

2.2 不同處理對茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組分的影響

2.2.1 不同處理對茶園土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組分的影響 從圖1中不同處理茶園土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組分分析結(jié)果可以看出，不同處理茶園土壤所含細菌屬的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化。從對照土樣中共檢測出441個細菌屬，總數(shù)是14 944個；從T1處理土樣中共檢測到493個細菌屬，總數(shù)是8 529個；從T2處理土樣中共檢測到535個細菌屬，總數(shù)是9 672個。隨著有機肥施用量的增加，檢測出的細菌屬的種類增加。

在檢測出的所有細菌屬中，除去未檢測到的和未命名的，將各處理細菌屬含量排名前10的列出。由表2可知，不同處理的茶園土壤中優(yōu)勢細菌屬的種類和數(shù)量均有差異，其中數(shù)量達到總數(shù)2%以上的細菌屬，對照有6種，分別為Gp1、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、Gp3、Gp6、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和生絲微菌屬(Rhizomicrobium)；T1處理中數(shù)量達到總數(shù)2%以上的有10個屬，分別為沙雷氏菌屬(Serratia)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、食酸菌屬(Acidovorax)、綠膿桿菌(Pseudomonas)、發(fā)光細菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)、戴爾福特菌屬(Delftia)、Gp4、鐵桿菌屬(Ferruginibacter)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)；T2處理土壤中數(shù)量達到總數(shù)2%以上的有7個屬，分別為假單胞菌屬(Pseudomonas)、Gp4、Gp1、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、發(fā)光細菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 不同處理土壤中優(yōu)勢細菌屬含量及占比

由表2還可以看出，不同處理茶園土壤優(yōu)勢菌屬種類及其占比均發(fā)生了變化。與對照相比，施用有機肥數(shù)量增加的細菌有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、發(fā)光菌屬和黃色桿菌屬等。其中，乳酸桿菌屬于厭氧性微生物，關(guān)于乳酸桿菌的應(yīng)用在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)上已有很多人進行研究[7-8]，但是其在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用研究很少。發(fā)光細菌是一種在正常的生理條件下能夠發(fā)射可見熒光的細菌，發(fā)光細菌及其發(fā)光基因在環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用價值，可以用來檢測土壤毒性[9-11]。黃色桿菌屬對農(nóng)田中的對鱗翅目害蟲有很好的防治作用，可用來殺死菜青蟲[12]。至于茶園土壤中這些細菌的功能和作用到底是什么尚不得而知，須要進一步探討與研究。

2.2.2 不同處理對茶園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組分的影響 從圖2的不同處理對茶園土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)組分的影響可以看出，不同施肥處理的茶園土壤所含真菌屬的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化，其中從對照中檢測出47個真菌屬，總數(shù)是5 687個；從T1處理中檢測到64個真菌屬，總數(shù)是86 112個；從T2處理檢測到70個真菌屬，總數(shù)是11 736個。

在檢測出的所有真菌屬中，除去未檢測到的和未命名的，將各處理真菌屬數(shù)量排名前10的列出，由表3可以看出，占比達到2%以上的真菌屬數(shù)量作為優(yōu)勢菌屬，對照中優(yōu)勢真菌屬有4種，分別為粗糙孔菌屬(Trechispora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)；T1處理有8種，分別為接合菌綱未命名屬(unclassified Zygomycota)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)、原金蝗屬(Gongronella)、糙孢孔目-未命名屬(unclassified Trechisporales)、紅酵母(Rhodotorula)和Umbelopsis；T2處理有8種，分別為隱球菌屬(Cryptococcus)、糙孢孔目未命名屬(Unclassified Trechisporales)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紅酵母(Rhodotorula)、皮司霉屬(Guehomyces)、Adisciso、被孢霉屬(Mortierella)和Mrakia。

從表3還可看出，不同處理下茶園土壤的優(yōu)勢真菌屬種類及其占比均發(fā)生了變化。與對照相比，施用有機肥后數(shù)量增加的真菌主要有鐮刀菌屬、隱球菌屬和被孢霉屬等，從T1、T2處理中均檢測到了紅酵母。有研究表明，鐮刀菌屬廣泛分布于自然界中，能產(chǎn)生植物刺激素(赤霉素)，可使農(nóng)作物增產(chǎn)，同時也是一類重要的植物病原菌，能引起許多植物病害，如由禾谷鐮刀菌為病原的小麥赤霉病是寧夏小麥的常發(fā)性病害[13]；然而，鐮刀菌在植物線蟲防治方面卻有重要作用，而且非致病性鐮刀菌還可用來防治鐮刀菌病害。壺菌門是高等植物的寄生蟲，雖然對植物生長的直接影響不大，但是其游動孢子是傳播土壤中一些病毒的介體，研究發(fā)現(xiàn)，壺菌門的玉蜀黍節(jié)壺菌能引起玉米褐斑病，內(nèi)生集壺菌能引起馬鈴薯癌腫病，因此，該菌的減少有助于土壤環(huán)境的改善。紅酵母是一種腐生菌，可分解多種物質(zhì)，是天然的清潔工[14]。然而，這些茶園土壤中的優(yōu)勢真菌到底有什么樣的功能尚不清楚，如何篩選出具有促生型或抗病型功能的有益菌值得進一步研究。

表3 不同處理優(yōu)勢真菌屬含量及其占比

2.3 不同處理對茶園土壤生物多樣性的影響

α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，計算群落分布豐度(community richness)的指數(shù)有Chao指數(shù)、ACE指數(shù)，這2個指數(shù)用來估計群落中OTU(操作分類單元)數(shù)。用Shannon指數(shù)來計算群落分布多樣性(community diversity)，Shannon值越大，說明群落的多樣性越高。用各樣品文庫的覆蓋率可以反映測序結(jié)果的真實情況。

由表4不同處理對茶園土壤細菌多樣性的影響結(jié)果可知，在97%分類水平下，不同施肥處理下微生物OTU數(shù)量、Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)有所差異。Chao指數(shù)的大小順序為T2>CK>T1；ACE指數(shù)的大小順序為T2>CK>T1；Shannon指數(shù)的大小順序為CK>T2>T1。由此可見，施用有機肥可提高茶園土壤細菌的豐度，但并未提高細菌群落的多樣性。

由不同施肥處理對茶園土壤真菌多樣性的影響(表5)可知，Chao指數(shù)表現(xiàn)為T2>CK>T1，ACE指數(shù)表現(xiàn)為T2>CK>T1，Shannon指數(shù)表現(xiàn)為T2>T1>CK。以上結(jié)果表明，有機肥的施入并不一定會提高真菌的豐度，但對于豐富土壤真菌的多樣性是有利的。

3 討論與結(jié)論

目前，高通量測序方法已經(jīng)成為研究不同地區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及組成的主要方法。劉洋等分析了基于454高通量測序的黃土高原不同喬木林土壤細菌群落特征，結(jié)果表明，

表4 不同處理對茶園土壤細菌多樣性的影響

表5 不同處理對茶園土壤真菌多樣性的影響

不同喬木林土壤中的優(yōu)勢菌來自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)，主要優(yōu)勢菌綱為放線桿菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacte ria)、酸桿菌(Acidobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteo bacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)[15]。汪其同等基于高通量測序分析了楊樹人工林根際和非根際細菌群落結(jié)構(gòu)的不同，發(fā)現(xiàn)根際和非根際相對豐度>4%的屬有8個，分別是Acidobacterium、Gp1、Acidobacterium、Gp3、Acidobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Bradyrhizobium、Burkholderia、Streptomyces和AcidobacteriumGp4[16]。α多樣性分析表明，根際土壤細菌群落多樣性高于非根際土壤，但差異未達到顯著水平。

施用有機肥對土壤微生物的影響已有很多研究，朱慶松等分析了不同覆蓋措施對信陽毛尖茶園土壤微生物量動態(tài)變化的影響，結(jié)果表明，稻草覆蓋處理與白三葉覆蓋處理均能增加土壤微生物的數(shù)量和活性[17]。朱海平等通過分析不同培肥管理措施對土壤微生物生態(tài)特征的影響發(fā)現(xiàn)，施入廄肥、化肥或秸桿還田均能明顯增加土壤微生物生物量及呼吸量[18]。林新堅等研究表明，施用有機肥可有效改善土壤物理性狀，增加土壤微生物總量[19]。王鵬研究發(fā)現(xiàn)，有機生物活性肥料能夠促進土壤中有益微生物的繁衍，有效提高土壤酶生物活性[20]。單武雄等發(fā)現(xiàn)，施用菜籽餅肥加稻草覆蓋處理可以顯著提高0～20 cm土層的蚯蚓數(shù)量和生物量、氨氧化細菌、好氣性自生固氮菌、嫌氣性自生固氮菌、放線菌、真菌和細菌等物生物數(shù)量[21]。溫延臣等研究發(fā)現(xiàn)，施用有機肥以及有機無機配肥與化肥相比，土壤微生物碳、氮含量分別增加50%～112%、34%～79%，提高了土壤活性養(yǎng)分供應(yīng)能力[22]?？傮w來說，施用有機肥可以增加土壤中微生物的數(shù)量，但是目前基于高通量測序的方法對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的研究尚不多見。

因此，本試驗運用Miseq測序平臺研究了有機肥施用量對茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性的影響，結(jié)果表明，增施有機肥可以改變茶園土壤微生物的OTU數(shù)量和種類，且隨著施肥量增加，茶園土壤微生物的OTU豐度越高。不同施肥處理的茶園土壤所含微生物屬的種類和數(shù)量都有所差異，隨著有機肥施用量的加大，可檢測出的細菌和真菌屬的種類也變多。