刺玫果總皂苷的提取方法及抗氧化活性研究

劉金璐， 雷永平， 王曉林， 鐘方麗

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022)

刺玫果是薔薇科薔薇屬植物山刺玫(RosadavuricaPall.)的成熟果實(shí)，具有抗衰老、耐缺氧、防治心腦血管疾病等作用，藥食同源且無(wú)毒副作用，具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[1-3]。據(jù)報(bào)道，刺玫果含有的皂苷類物質(zhì)具有降血糖、降血脂、抗病毒、抑制腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[4-5]。微波協(xié)同酶提取法是近年來(lái)應(yīng)用較廣泛的一種植物有效成分的提取新技術(shù)，具有高效、無(wú)毒、易控制等優(yōu)點(diǎn)，而且得到的產(chǎn)物穩(wěn)定，純度、活性較高[6-7]。本試驗(yàn)對(duì)微波協(xié)同酶法提取刺玫果總皂苷的工藝條件進(jìn)行了研究，并探索了刺玫果總皂苷提取物的體外抗氧化活性，以期為刺玫果的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果，由吉林省延吉市林業(yè)局提供，經(jīng)鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫的成熟果實(shí)；齊墩果酸對(duì)照品，成都曼思特生物科技有限公司；纖維素酶(生化試劑)，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；香草醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1，1- 二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)，上海如吉生物科技有限公司；鄰二氮菲，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、無(wú)水乙醇、高氯酸、冰乙酸、石油醚(60～90 ℃)、硫酸亞鐵等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；FA3204B型電子天平，上海天美天平儀器有限公司；W5-100SP型恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；MAS-II型微波萃取儀，上海新儀化學(xué)科技有限公司；SHZ-D型循環(huán)水真空泵，河南省鞏義市英峪儀器一廠；DZ-2BCII 型真空干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取在105 ℃干燥4 h至恒重的齊墩果酸對(duì)照品0.19 mg，置于10 mL的容量瓶中，加無(wú)水甲醇適量使其溶解，定容，配制成質(zhì)量濃度為0.19 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再取對(duì)照品儲(chǔ)備液10 mL置于50 mL容量瓶中，無(wú)水甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為38 μg/mL的對(duì)照品溶液。精確量取上述齊墩果酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于具塞試管中，80 ℃水浴揮干溶劑，分別加入7%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于70 ℃加熱25 min，取出，冰浴15 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，室溫靜置15 min后，以不顯色的對(duì)照品溶液為空白，用分光光度法在548 nm處測(cè)定吸光度[8]。

1.3.2 刺玫果干浸膏中總皂苷的含量測(cè)定 精確稱取干燥的刺玫果干浸膏粉0.16 g，加入適量甲醇超聲處理2次，每次15 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。吸取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞試管中，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，計(jì)算提取量。

1.3.3 含量測(cè)定的方法學(xué)研究

1.3.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，參照“1.3.1”節(jié)方法操作，用分光光度法，在400～650 nm范圍內(nèi)掃描。

1.3.3.2 方法學(xué)研究 精密度試驗(yàn)：吸取對(duì)照品溶液 0.1 mL 置于10 mL具塞試管中，按“1.3.1”節(jié)方法在548 nm波長(zhǎng)處連續(xù)5次測(cè)定其吸光度，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批刺玫果干浸膏樣品5份，分別稱取0.16 g，按“1.3.1”節(jié)方法制備供試品溶液并測(cè)定其吸光度，計(jì)算其RSD[9]；穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取供試品溶液0.1 mL置于 10 mL 具塞試管中，分別在供試品溶液制備后的0、1、2、3、4、5 h，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定其吸光度，考察供試品溶液的穩(wěn)定性[10]?；厥章试囼?yàn)：精確稱取己知含量的刺玫果干浸膏5份，每份0.1 g，每份供試品中分別加入齊墩果酸對(duì)照品 4.0 mg，按“1.3.2”節(jié)方法制備供試品溶液并測(cè)定其吸光度，計(jì)算加樣回收率。

1.3.4 刺玫果總皂苷提取方法的選擇

1.3.4.1 回流提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾液回收乙醇，水浴濃縮成稠膏，然后放入60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥，制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量[11]。

1.3.4.2 微波提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇，進(jìn)行微波提取2 h，過(guò)濾，濾液按“1.3.4.1”節(jié)方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量[12]。

1.3.4.3 酶解提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g纖維素酶，加熱提取2 h，過(guò)濾，濾液按“1.3.4.1”節(jié)方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量[13]。

1.3.4.4 微波協(xié)同酶提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g纖維素酶，加熱回流提取 2 h，然后再進(jìn)行微波輔助提取5 min，過(guò)濾，濾液按“1.3.4.1”節(jié)方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量[14]。

1.3.4.5 微波協(xié)同表面活性劑提取法 稱取4 g刺玫果粗粉，放入到燒瓶中，加入60%乙醇與0.02 g表面活性十二烷基硫酸鈉，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾液按“1.3.4.1”節(jié)方法制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量[15]。

1.3.5 微波協(xié)同酶提取法的優(yōu)化 稱取刺玫果粗粉適量，放入到燒瓶中，加入提取溶劑與纖維素酶適量，加熱提取至一定時(shí)間，然后再進(jìn)行微波輔助提取，過(guò)濾，濾液回收乙醇，水浴濃縮成稠膏，然后放入60 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥制備刺玫果干浸膏，按“1.3.1”節(jié)方法測(cè)定干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量。以總皂苷的提取量為參考指標(biāo)，分別考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時(shí)間、微波提取溫度、微波提取時(shí)間、微波功率對(duì)提取效果的影響，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)[16]。

1.3.6 工藝驗(yàn)證性試驗(yàn) 稱取4 g刺玫果粗粉3份，分別放入到燒瓶中并加入55%乙醇溶液與纖維素酶適量，加熱提取2 h，再微波輔助提取8 min，過(guò)濾，濾液按“1.3.4.1”節(jié)方法制備刺玫果干浸膏，測(cè)定3組干浸膏中總皂苷的含量，并計(jì)算提取量，求出其平均值及RSD。

1.3.7 體外抗氧化性的考察

1.3.7.1 刺玫果總皂苷對(duì)DPPH·的清除能力 精確稱取DPPH·適量，配制成0.2 mmol/mL的無(wú)水乙醇溶液。將刺玫果總皂苷配制成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL的無(wú)水乙醇溶液[17]。分別吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液2 mL于10 mL比色管中，分別加入上述DPPH·無(wú)水乙醇溶液2 mL，混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min后，以50%乙醇作參比，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度為D樣品。用2 mL蒸餾水代替上述供試品溶液，測(cè)其吸光度為D空白。用2 mL無(wú)水乙醇代替上述DPPH·無(wú)水乙醇溶液，測(cè)其吸光度為D對(duì)照[18]。清除率按下式計(jì)算：

DPPH·清除率=[(D空白-D樣品+D對(duì)照)/D空白]×100%。

(1)

1.3.7.2 刺玫果總皂苷對(duì)·OH的清除能力 吸取 1.5 mmol/L 的鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1 mL于10 mL比色管中，依次加入磷酸鹽緩沖液PBS(0.2 mol/L)2 mL和蒸餾水 1 mL、0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，充分混勻，加入1 mL的0.1% H2O2，于37 ℃下恒溫反應(yīng)60 min，于536 nm處測(cè)其吸光度(DP)。同前步，其中用1 mL蒸餾水代替0.1% H2O2，測(cè)得吸光度(Db)。用供試品溶液1 mL代替上述的 1 mL 蒸餾水，測(cè)得吸光度(Ds)[19]。清除率按下式計(jì)算：

·OH清除率=[(Ds-DP)/(Db-DP)]×100%。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程：D=0.137 2C+0.0337 4，r=0.999 5。結(jié)果表明，齊墩果酸在0.633 3～5.066 7 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 含量測(cè)定的方法學(xué)研究

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 試驗(yàn)結(jié)果表明，齊墩果酸對(duì)照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為548 nm，而且二者峰型相似，所以選擇548 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 方法學(xué)研究 試驗(yàn)結(jié)果表明精密度試驗(yàn)的RSD為 1.37%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為1.72%，表明該方法重復(fù)性符合要求；由穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可知，樣品溶液在1.5 h內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)吸光度有下降趨勢(shì)，因此供試品溶液最好在1.5 h內(nèi)測(cè)定完成。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的平均回收率為99.50%，RSD為 1.52%(表1)。

表1 回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.3 提取方法的選擇

試驗(yàn)結(jié)果表明，回流提取法，微波提取法、酶解提取法、微波協(xié)同酶提取法、微波協(xié)同表面活性劑提取法對(duì)刺玫果總皂苷的提取量分別為12.89、11.37、11.92、18.56、18.41 mg/g，其中微波協(xié)同酶提取法的提取量最高，所以選擇該方法作為刺玫果總皂苷的提取方法，進(jìn)行深入研究。

2.4 微波協(xié)同酶提取法的優(yōu)化

2.4.1 單因素試驗(yàn)

2.4.1.1 料液比對(duì)提取量的影響 在提取體系中加入4 g刺玫果粗粉和0.02 g的纖維素酶，酶解水浴溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為2 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，微波時(shí)間為5 min，微波功率為500 W，微波溫度50 ℃。分別以料液比(g ∶mL)1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40按“1.3.4.5”節(jié)方法進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺玫果總皂苷的提取量在料液比為1 g ∶25 mL時(shí)達(dá)到較高水平，之后隨著料液比的增大呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)(圖1)。為了進(jìn)一步考察料液比對(duì)提取量的影響，選擇料液比分別為1 ∶24、1 ∶28、1 ∶32、1 ∶36(g ∶mL)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.1.2 酶解時(shí)間對(duì)提取量的影響 設(shè)定酶解時(shí)間分別為1、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4 h，其他按“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解2 h時(shí)刺玫果總皂苷的提取量達(dá)到最高，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，提取量反而略有下降的趨勢(shì)(圖2)。為了進(jìn)一步考察酶解時(shí)間對(duì)提取量的影響，選擇酶解時(shí)間為1.6、1.8、2.0、2.2 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.1.3 酶解溫度對(duì)提取量的影響 設(shè)定酶解水浴溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，其他按“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶解水浴溫度為70 ℃時(shí)刺玫果總皂苷的提取量達(dá)到最高，之后隨著酶解水浴溫度的升高而略有下降的趨勢(shì)(圖3)。為了進(jìn)一步考察酶解水浴溫度對(duì)提取量的影響，選擇酶解水浴溫度為65、70、75、80 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響 設(shè)定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%，其他按“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)刺玫果總皂苷的提取量達(dá)到最高，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加反而表現(xiàn)出略有下降的趨勢(shì)(圖4)。為了進(jìn)一步考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、60%、65%、70%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.1.5 微波溫度對(duì)提取量的影響 設(shè)定微波溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，按方“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波溫度70 ℃條件下刺玫果總皂苷的提取量達(dá)到最高水平，之后隨著溫度的上升提取量明顯降低(圖5)。為了進(jìn)一步考察微波溫度對(duì)提取量的影響，選擇微波溫度為60、65、70、75 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.1.6 微波提取時(shí)間對(duì)提取量的影響 設(shè)定微波時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 min，其他按“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波時(shí)間為8 min時(shí)刺玫果總皂苷的提取量達(dá)到最高，之后隨著微波時(shí)間的增加提取量略下降后趨于較平穩(wěn)狀態(tài)(圖6)。因此，微波時(shí)間定為8 min。

2.4.1.7 微波功率對(duì)提取量的影響 設(shè)定微波功率分別為300、400、500、600、700 W，按“2.4.1.1”節(jié)方法進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微波功率600 W條件下刺玫果總皂苷的提取量最高，隨后隨著微波功率的增加提取量變化較小(圖7)。因此，微波功率定為600 W。

2.4.2 正交試驗(yàn)

2.4.2.1 因素與水平的設(shè)定 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、酶解水浴溫度、酶解時(shí)間、微波溫度、微波功率5個(gè)因素，每個(gè)因素選擇4個(gè)水平(表2)。

2.4.2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 取刺玫果適量，放入到燒瓶中，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)刺玫果總皂苷提取量的影響順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>酶解水浴溫度>料液比>乙醇

表2 正交試驗(yàn)因素水平

體積分?jǐn)?shù)>微波溫度。其最佳提取工藝條件為A4B3C2D2E1，即料液比為1 g ∶36 mL，酶解時(shí)間2 h，酶解水浴溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%，微波溫度60 ℃，微波功率 600 W，微波時(shí)間為8 min(表3)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.3 工藝驗(yàn)證性試驗(yàn) 為了考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性，按照正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝條件提取3次，刺玫果總皂苷提取量分別為31.33、31.44、31.65 mg/g，平均值為 31.47 mg/g，RSD值為0.53%，表明該提取工藝具有良好穩(wěn)定性。

2.5 體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.5.1 刺玫果總皂苷對(duì)DPPH·的清除能力 按“1.3.3.1”節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，研發(fā)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刺玫果總皂苷的質(zhì)量濃度較低時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)DPPH·的清除率迅速上升，當(dāng)總皂苷的質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到91.14%，繼續(xù)提高刺玫果總皂苷的質(zhì)量濃度，DPPH·清除率變化較小(圖8)。試驗(yàn)結(jié)果表明，刺玫果總皂苷對(duì)DPPH·具有較強(qiáng)的清除能力。

2.5.2 刺玫果總皂苷對(duì)·OH的清除能力 按“1.3.3.2”節(jié)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著總皂苷質(zhì)量濃度的升高，·OH的清除率不斷增加，當(dāng)總皂苷的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，·OH 的清除率達(dá)到73.68%，繼續(xù)提高刺玫果總皂苷的質(zhì)量濃度，·OH的清除率變化不明顯(圖9)。試驗(yàn)結(jié)果表明，刺玫果總皂苷對(duì)·OH具有一定的清除能力。

3 結(jié)論

刺玫果是具有多種藥理活性的天然產(chǎn)物，具有廣泛的開(kāi)發(fā)前景。本研究比較了多種提取方法對(duì)刺玫果總皂苷的提取量，并對(duì)刺玫果總皂苷的體外抗氧化活性及其含量測(cè)定方法進(jìn)行了考察。試驗(yàn)結(jié)果表明，微波協(xié)同酶提取法對(duì)刺玫果總皂苷的提取量最高，并采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)微波協(xié)同酶提取法進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳提取工藝條件為料液比為 1 g ∶36 mL、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、微波溫度60 ℃、微波功率600 W、微波時(shí)間為8 min，在上述提取條件下刺玫果總皂苷的提取量可以達(dá)到 31.47 mg/g。刺玫果總皂苷含量測(cè)定的方法學(xué)研究結(jié)果表明，該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、線性關(guān)系良好，回收率、重現(xiàn)性符合要求，可用于刺玫果總皂苷的含量測(cè)定。體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，刺玫果總皂苷溶液對(duì)·OH、DPPH·均具有一定

的清除能力。