孔雀魚胚后發(fā)育的器官組織學(xué)發(fā)生研究

方珍珍， 范 強(qiáng)， 陶秉春， 陳成勛

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

孔雀魚(Poeciliareticulata)別稱彩虹魚、虹鳉、花鳉、百萬魚，英文名guppy，原產(chǎn)于南美洲和西印度群島，孔雀魚屬鳉形目(Cyprinodontiformes)胎鳉科(Poeciliidae)[1]。因其游動(dòng)起來美麗的花尾巴猶如孔雀開屏，故名孔雀魚。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該魚的研究涉及多個(gè)領(lǐng)域，如繁殖生物學(xué)領(lǐng)域[2]、生化遺傳學(xué)領(lǐng)域[3-5]等，對(duì)其胚胎學(xué)的研究有胚胎心血管發(fā)育等[6]，涉及其器官組織發(fā)生的有精子的發(fā)生等[7]，并對(duì)其滯后育雛[8]、體長(zhǎng)分化[9]及胚心的體外培養(yǎng)[10]等進(jìn)行了研究。本研究對(duì)即將產(chǎn)魚及剛產(chǎn)后的孔雀魚整體固定后，經(jīng)常規(guī)石蠟組織切片技術(shù)制成組織切片，用生物顯微鏡對(duì)器官組織發(fā)生進(jìn)行較系統(tǒng)的組織學(xué)觀察。旨在通過對(duì)母體內(nèi)幼魚的器官、組織進(jìn)行觀察，獲取相關(guān)資料，以期為孔雀魚的器官組織發(fā)生研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2015年4月取自天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖中心實(shí)驗(yàn)室Ⅲ養(yǎng)殖的孔雀魚，當(dāng)雌魚肛門2側(cè)的胎斑變大變黑時(shí)，即是臨產(chǎn)征兆[11]，6尾試驗(yàn)用魚平均體長(zhǎng)為2.3 cm，平均體質(zhì)量為 1.5 g。

1.2 方法

先后挑取6尾體質(zhì)健壯、無傷無病的臨產(chǎn)孔雀魚停食 24 h 后用Bouin’s液固定，11 h后放入70%乙醇中備用。將保存在70%乙醇溶液中備用的臨產(chǎn)孔雀魚取出，再用70%乙醇溶液沖洗4～5次，洗去殘色。叔丁醇逐級(jí)脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5～6 μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。采用Motic BA600-4數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)高精度掃描切片并保存。之后用Motic數(shù)字切片助理Lite 1.0觀察組織，采集圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化系統(tǒng)

孔雀魚的口腔在胚胎后期階段已發(fā)育成型，產(chǎn)出后即能攝食，咽部有味蕾鑲嵌于黏膜表面(圖1-1，40×，TB表示味蕾)。胚胎后期階段孔雀魚的食道已經(jīng)形成，其管腔開通。黏膜向腔面褶成皺襞，皺襞之間為固有膜，黏膜表面襯裱著復(fù)層鱗狀上皮，在表層上皮之間有杯狀細(xì)胞，可分泌黏液；黏膜下層僅由疏松結(jié)締組織構(gòu)成；肌層發(fā)達(dá)；漿膜為食道最外層，由薄層結(jié)締組織組成(圖1-2，20×，Mu表示肌層，LP表示固有膜，GC表示杯狀細(xì)胞)?？兹隔~在胚胎后期階段腸道已形成并形成腸腔，黏膜未向腸腔突起形成皺襞，黏膜表面襯裱著單層柱狀上皮，包含著吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞2種細(xì)胞。吸收細(xì)胞數(shù)量較多，呈高柱狀，細(xì)胞核靠近細(xì)胞基部，細(xì)胞的游離面具有明顯的紋狀緣；杯狀細(xì)胞不明顯；固有膜及黏膜下層不明顯，肌層較??；漿膜由間皮及一薄層結(jié)締組織構(gòu)成，腸腔內(nèi)有分泌物質(zhì)(圖1-3，10×，Se表示漿膜；圖1-4，40×，CC表示柱狀細(xì)胞，SB表示紋狀緣)?？兹隔~在胚胎后期階段肝臟已形成，為一實(shí)質(zhì)性的器官。肝臟的最外面被疏松結(jié)締組織包裹，伸入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)的結(jié)締組織很少，肝小葉的間隔不明顯；肝小葉中央有一血管為中央靜脈；肝細(xì)胞形態(tài)不明顯，僅見其細(xì)胞核呈圓球形，位于中央；肝血竇清晰，其形狀不規(guī)則(圖1-5，10×，HS表示肝血竇，CV表示中央靜脈)?？兹隔~的胰臟在胚胎后期階段已經(jīng)形成，分布復(fù)雜散亂，彌散于腸系膜上；胰腺腺泡上分泌物明顯(圖1-6，10×)。

2.2 呼吸系統(tǒng)

孔雀魚的鰓在胚胎后期階段已經(jīng)形成。有4片鰓，鰓弓明顯，由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成，內(nèi)有軟骨細(xì)胞，鰓弓下方有出鰓動(dòng)脈和入鰓動(dòng)脈2支血管平行排列，鰓弓和血管之間有結(jié)締組織填充；鰓弓一側(cè)為鰓耙，另一側(cè)為鰓絲固著其上，鰓絲另一端游離；鰓絲上的鰓小片發(fā)育不完善(圖1-7，10×，GA表示鰓弓，Gr表示鰓耙，→表示出鰓動(dòng)脈，←表示入鰓動(dòng)脈)。

孔雀魚的偽鰓在胚胎后期階段即已發(fā)育成型，毛細(xì)血管清晰；鰓片排列不如正常鰓片有序；鰓片中有許多小片，小片較密集；上皮細(xì)胞近于立方狀，其細(xì)胞核頗大，圓形，位于細(xì)胞邊緣(圖1-8，×40，BL表示鰓小片，EC表示上皮細(xì)胞)。

2.3 排泄器官

孔雀魚的頭腎在胚胎后期階段已經(jīng)形成，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，由腎主質(zhì)和腎間質(zhì)組成。腎主質(zhì)由前腎小管和腎小球構(gòu)成，前腎小管由單層上皮細(xì)胞組成，腎小球由腎小囊內(nèi)的毛細(xì)血管盤曲而成；腎間質(zhì)含有豐富的造血細(xì)胞，具有造血功能(圖1-9，40×，RC表示腎小體，UT表示腎小管)。

孔雀魚的中腎在胚胎后期階段已經(jīng)發(fā)育成型，已經(jīng)具有排泄功能，由腎間質(zhì)與腎實(shí)質(zhì)組成。腎小管管壁為單層立方上皮，細(xì)胞游離端有刷狀緣(圖1-10，40×，UT表示腎小管)。腎小球發(fā)育完善，毛細(xì)血管壁較厚；腎小囊內(nèi)包裹著血管球，囊壁分臟層和壁層，臟層與壁層之間有一狹窄的腔隙，為囊腔，外壁由單層扁平細(xì)胞構(gòu)成，孔雀魚在胚胎后期階段已形成脾臟，發(fā)育不完善，其紅髓和白髓清晰可見，但兩者分界明顯，各位于一側(cè)，不為紅白相間；脾臟表層為皮質(zhì)，內(nèi)部為髓質(zhì)，由大量紅血球及結(jié)締組織構(gòu)成。(圖1-11，40×，RP表示紅髓，WP表示白髓)。

2.4 內(nèi)分泌器官

孔雀魚的胸腺在胚胎階段后期已經(jīng)形成，皮質(zhì)與髓質(zhì)清晰易辨，紅白髓相間；髓質(zhì)里淋巴細(xì)胞染色較深(圖1-12，40×，Co表示皮質(zhì)，Me表示髓質(zhì))。

孔雀魚的甲狀腺在胚胎后期階段已發(fā)育成型，為彌散性的，分布于腹主動(dòng)脈和第Ⅰ至第Ⅲ鰓動(dòng)脈周圍的鰓區(qū)間隙組織里，由甲狀腺腺泡組成，腺泡內(nèi)為嗜酸性染色的膠體，腺細(xì)胞核為圓形(圖1-13，40×，TG表示甲狀腺)。

孔雀魚的腦垂體在胚胎后期階段已發(fā)育成型，其上神經(jīng)部和腺垂體清晰可辨，與間腦相連，位于間腦的腹面(圖1-14，5×，HY表示腦垂體，Di表示間腦；圖1-15，40×，PN表示神經(jīng)部，Ad表示腺垂體，Di表示間腦)。

2.5 感覺器官

在胚胎后期階段，孔雀魚的嗅囊已發(fā)育成型?；?xì)胞清晰，固有膜由結(jié)締組織構(gòu)成，含有血管；支持細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及嗅細(xì)胞形態(tài)不明顯，黏膜上皮的皺褶未形成。產(chǎn)出之后即具有感受食物所產(chǎn)生的化學(xué)刺激并尋找食物的作用(圖1-16，40×，BC表示基細(xì)胞，Ca表示毛細(xì)血管)。

孔雀魚在胚胎后期階段，眼睛已基本發(fā)育成型。晶體清晰，其實(shí)質(zhì)是由細(xì)長(zhǎng)的晶狀體纖維組成；視網(wǎng)膜清晰，在視網(wǎng)膜與晶體間的后房?jī)?nèi)存有大量的毛細(xì)血管；色素膜、脈絡(luò)膜、銀膜明顯；鞏膜內(nèi)有軟骨細(xì)胞分布；角膜由結(jié)締組織構(gòu)成，虹膜內(nèi)含血管和色素細(xì)胞，分布于晶體的2側(cè)(圖1-17，8×，Le表示晶體，Re表示視網(wǎng)膜，Pi表示色素膜，Co表示角膜，Ir表示虹膜；圖1-18，20×，Sc表示鞏膜)。孔雀魚的內(nèi)耳在胚胎后期階段已發(fā)育成型，可見聽嵴、聽斑、感覺毛(圖1-19，20×，Ma表示聽斑，←表示感覺毛)。

2.6 心臟

孔雀魚的心臟在胚胎后期階段已發(fā)育完善，其心耳、心室已分化成型，心耳的壁較薄，心室的壁較厚，能進(jìn)行血液循環(huán)(圖1-20，15×，At表示心耳，Ve表示心室)。

2.7 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

孔雀魚的腦在胚胎后期階段已分化成型，端腦、間腦、中腦、小腦及延腦發(fā)育完善(圖1-21，4×，Me表示中腦，M表示延腦，SC表示脊髓，Te表示端腦)。胚胎后期階段，孔雀魚脊髓組織結(jié)構(gòu)已發(fā)育完善，其灰質(zhì)區(qū)、白質(zhì)區(qū)清晰易辨(圖1-22，30×，WA表示白質(zhì)，GM表示灰質(zhì))孔雀魚在胚胎后期階段脊神經(jīng)節(jié)已發(fā)育成型，位于脊髓旁(圖1-22，30×，SG表示脊神經(jīng)節(jié)，SC表示脊髓，No表示脊索)?？兹隔~在胚胎后期階段皮膚發(fā)育完善但不明顯。頭部的皮膚含2層較薄的上皮細(xì)胞，真皮內(nèi)可見色素細(xì)胞，皮穴器官，僅有疏松層，未見膠原層(圖1-23，40×，Mel表示色素細(xì)胞，CO表示皮穴器官，)；軀干部皮膚未見疏松層；尾部皮膚可見色素細(xì)胞，表皮細(xì)胞為2層扁平細(xì)胞(圖1-24，40×，Mel表示色素細(xì)胞)。

3 結(jié)論與討論

3.1 性成熟與繁殖周期

本研究孔雀魚在養(yǎng)殖期所處水溫維持在29 ℃左右，從試驗(yàn)孔雀魚剛從母體中產(chǎn)出至處于臨產(chǎn)狀態(tài)，共計(jì)96 d。張宇認(rèn)為，孔雀魚屬于卵胎生魚類，直接產(chǎn)小魚，性成熟早，幼魚經(jīng)3—4個(gè)月飼養(yǎng)便進(jìn)入成熟期，可以繁殖后代，性成熟遲早與水溫高低、飼養(yǎng)條件密切相關(guān)[1]。可見孔雀魚的性成熟周期隨著水溫的變動(dòng)而有所不同。與試驗(yàn)魚所處相同環(huán)境下的其他孔雀魚，其雌魚達(dá)到性成熟后繁殖周期為21 d，這與觀賞水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)描述的繁殖周期30 d左右不相符[12]，可能與溫度高低有關(guān)。樓允東認(rèn)為，在適溫范圍內(nèi)，提高水溫可引起胚胎提前出膜；不適宜的溫度能使胚胎的某些結(jié)構(gòu)的發(fā)育特別加快或特別受到抑制而形成畸形發(fā)育[13]，本研究養(yǎng)殖孔雀魚在水溫為29 ℃左右時(shí)，產(chǎn)出的小魚中出現(xiàn)個(gè)別脊椎骨彎曲的情形。以成熟的雌魚為例，代謝速度過快，容易使魚體內(nèi)鈣質(zhì)加速流失，如果再加上產(chǎn)后失調(diào)，即有可能出現(xiàn)脊椎彎曲的情況，彎曲程度越大越容易壓迫內(nèi)臟，從而威脅孔雀魚的生存。

3.2 消化系統(tǒng)

孔雀魚胚胎后期食道已經(jīng)形成且有皺襞，有黏液細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，細(xì)胞的分泌物能潤(rùn)滑食物，有利于食物的運(yùn)輸[14]。葉元土等認(rèn)為，腸道對(duì)食物的消化和吸收主要與黏膜表面結(jié)構(gòu)和腸道的分泌能力有關(guān)[15]。杯狀細(xì)胞能分泌黏液和消化酶，一方面對(duì)上皮起潤(rùn)滑作用，另一方面與消化酶共同作用消化[14]。因此，杯狀細(xì)胞的多少可間接反映魚類的消化能力?？兹隔~胚胎后期杯狀細(xì)胞較少，腸腔內(nèi)表面紋狀緣清晰且腔內(nèi)含有吸收物，膽囊內(nèi)有膽汁分泌，可見孔雀魚胚胎后期已經(jīng)可以進(jìn)行食物的攝取和消化。

硬骨魚類肝臟的形態(tài)因種而異。多數(shù)硬骨魚類肝臟分葉，少數(shù)魚類肝臟僅由單葉構(gòu)成；肉食性硬骨魚類肝臟為實(shí)心腺體[16]，草食性或雜食性魚類其肝臟分散在腸系膜上，且混有胰腺組織?？兹隔~肝臟為實(shí)心腺體，體現(xiàn)了其雜食性魚類的特點(diǎn)。肝臟主要分泌膽汁，幫助消化脂肪。胰臟為彌散型，有少量胰臟組織伸入到肝臟中，大部分胰腺彌散于腸系膜中，胰腺細(xì)胞中有豐富的酶原顆粒。肝胰臟結(jié)構(gòu)特點(diǎn)說明孔雀魚對(duì)食物分解代謝能力較強(qiáng)。

3.3 排泄器官

硬骨魚類的腎臟一般分為頭腎、中腎、后腎3個(gè)部分。硬骨魚類的頭腎是重要的免疫和造血器官，其功能類似哺乳動(dòng)物的脊髓[17]，魚類抗菌、抗炎的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制與哺乳動(dòng)物類似，其在對(duì)虹鱒頭腎免疫機(jī)制研究中已得到驗(yàn)證[18]。魚類頭腎在胚胎時(shí)期起源于前腎，具有泌尿功能，成體后因魚類物種不同，其組織結(jié)構(gòu)及生理功能也存在較大差異，彈涂魚(Periophthalmuskoelreuteri)等魚類的頭腎中分布有許多與后腎一致的功能性腎單位結(jié)構(gòu)[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)孔雀魚頭腎與中腎一致，都具有功能性腎單位結(jié)構(gòu)?？兹隔~的頭腎也是機(jī)體重要的造血和免疫器官，且具有泌尿功能。

3.4 心臟

心臟的靜脈竇及動(dòng)脈球均未發(fā)現(xiàn)，由于心耳、心室已發(fā)育完善，其靜脈竇及動(dòng)脈球也已發(fā)育成型，可能為制片問題導(dǎo)致，試驗(yàn)操作有待進(jìn)一步改進(jìn)。

3.5 眼睛

孔雀魚在胚胎發(fā)育早期，晶體與視網(wǎng)膜之間存在豐富的毛細(xì)血管，目前尚不清楚毛細(xì)血管的作用，有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)孔雀魚在胚胎階段各個(gè)器官都已基本發(fā)育成型，仔魚產(chǎn)出后即能進(jìn)行平游，且可以攝食。隨著仔魚的發(fā)育，其各器官組織形態(tài)與胚胎階段是否存在差異目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，有待于進(jìn)一步研究。