柳葉栒子組培快繁體系的建立

馬媛春， 張粉粉， 程宗明

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095)

柳葉栒子(Cotoneastersalicifolius)為栒子屬植物，多生于山地溝邊雜林中、海拔1 800～3 000 m處，一般分布于我國的湖北、湖南、四川、貴州等地[1]。柳葉栒子的葉片呈革質(zhì)而油亮，果實(shí)紅而累累，不但可以作為一種優(yōu)美的園林植物來應(yīng)用，而且柳葉栒子是一味珍貴的中藥材，對(duì)于治療咳嗽、除風(fēng)熱有很好的療效。我國對(duì)栒子屬植物的研究和開發(fā)利用起步較晚。過去柳葉栒子主要依靠播種繁殖，不僅繁殖速度慢，繁殖的量也很少，柳葉栒子并沒有發(fā)揮其應(yīng)有的園林及藥用價(jià)值，關(guān)于柳葉栒子的研究更是少之又少，幾乎沒有。而如今，隨著組織培養(yǎng)[2]和細(xì)胞培養(yǎng)[3]等新技術(shù)的產(chǎn)生，使得柳葉栒子的大量擴(kuò)繁有了可能，通過組織培養(yǎng)技術(shù)將可以在短時(shí)間內(nèi)培育出大量柳葉栒子幼苗。除柳葉栒子外，我國還有57種栒子植物，約占全世界栒子植物數(shù)量的2/3，但是全國各地對(duì)于栒子引種栽培的報(bào)道很少[4-6]，關(guān)于組培快繁成功的案例更是少之又少。所以通過建立柳葉栒子組培快繁體系，對(duì)栒子屬植物的組培快繁體系的研究也有幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

以柳葉栒子的實(shí)生苗為試驗(yàn)材料(種子來自加拿大的城市公園，于2016年3月份播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生科樓7樓果樹生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室育苗室)，進(jìn)行消毒滅菌后，接種培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 選取長勢(shì)較好的實(shí)生苗，剪切成4 cm左右的帶芽莖段作為試驗(yàn)材料，放入容器中，在自來水下沖洗2 h，后移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，用70%乙醇浸泡外植體30 s后用無菌水沖洗3次，然后用濃度為4%的次氯酸鈉分別處理3、4、5、6 min，再用無菌濾紙吸干莖段表面的水分[7]，將其切成 1 cm 左右的帶芽莖段，最好可以保留1～2張小葉片，再接種[8]。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將無菌莖段接種到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，首先為了確定腋芽在哪種基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的效果更好，選取MS、1/2MS、1/2WPM 3種基本培養(yǎng)基[9]，在3種基本培養(yǎng)基內(nèi)添加濃度相同的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)[10]進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，20 d后發(fā)現(xiàn)，腋芽在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的效果最好，因此在初代培養(yǎng)時(shí)選擇MS作為基本培養(yǎng)基，另外發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入抗菌物質(zhì)1.2 mg/L PPM(plant preservative mixture，植物組培抗菌劑)可以大大降低污染率[11-12]。由于初代培養(yǎng)的目的是為了誘導(dǎo)新芽，因此加入的細(xì)胞分裂素的濃度應(yīng)高一些，生長素的濃度應(yīng)該低一些[13-14]，本試驗(yàn)選取的細(xì)胞分裂素為6-BA，濃度為0.5～3.0 mg/L，生長素為NAA(即α-萘乙酸，在預(yù)試驗(yàn)中，得出最適宜的NAA濃度為 0.02 mg/L)，共組成4種培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM。在每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，先放置在暗環(huán)境[15-16]中培養(yǎng)1周，再移至光環(huán)境下培養(yǎng)，來減輕褐化現(xiàn)象[17-18]，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率。

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)30 d的組培苗新生芽剪下，切成1 cm左右的帶芽莖段，保留1～2張小葉片，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)。首先經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)，確定繼代培養(yǎng)的最佳基本培養(yǎng)基也是MS培養(yǎng)基，并且發(fā)現(xiàn)繼代培養(yǎng)時(shí)不適宜加入NAA、IBA，只適宜加入6-BA[19-21]，濃度為0.5～2.0 mg/L，共組成4種培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖率。

1.2.4 壯苗培養(yǎng) 由于前面階段所獲得的柳葉栒子無菌苗都比較矮小，不適宜直接用于誘導(dǎo)生根，需要經(jīng)過壯苗培養(yǎng)，使苗長得強(qiáng)壯一些再進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 這個(gè)階段主要是誘導(dǎo)組培苗生出不定根[22-23]。在壯苗培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)，組培苗在1/2MS、F培養(yǎng)基內(nèi)有生根現(xiàn)象，因此選擇F、1/2MS作為生根的基本培養(yǎng)基。另外在壯苗培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)，生長素濃度過高的培養(yǎng)基中幾乎沒有生根現(xiàn)象[14]，因此在生根培養(yǎng)基中選擇加入低濃度的NAA，濃度為0～0.1 mg/L，IBA濃度為0～0.3 mg/L，共組成8種培養(yǎng)基：1/2MS+0.05 mg/L NAA、1/2MS+0.1 mg/L IBA、1/2MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.05 mg/L NAA、F+0.1 mg/L IBA、F+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA、F+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.6 組培苗的馴化移栽

1.2.6.1 組培苗的馴化 將生根健壯的組培苗從培養(yǎng)室移出來，放入溫室內(nèi)，共6種煉苗方式：閉瓶煉苗0 d，開瓶煉苗0 d；閉瓶煉苗0 d，開瓶煉苗7 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗0 d；閉瓶煉苗4 d，開瓶煉苗3 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗4 d；閉瓶煉苗7 d，開瓶煉苗7 d。每種方式處理20瓶，每瓶1個(gè)外植體，重復(fù)3次。為了防止在開瓶煉苗期間濕度降低造成小苗干枯，每天要定時(shí)用純凈水噴灑小苗1次。

1.2.6.2 組培苗的馴化 在經(jīng)過一段時(shí)間的煉苗處理之后，將長勢(shì)依舊茁壯的小苗從瓶中移出來，在移出來的過程中要用鑷子慢慢地小心地夾取小苗，以免小苗受到破壞。然后再將小苗放在自來水下，將殘留的培養(yǎng)基物質(zhì)沖洗干凈。另外還要剪去小苗多余的葉片，以降低小苗的蒸騰作用，沖洗干凈后把小苗移入蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比=2 ∶1 ∶1的基質(zhì)中，移栽之前應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行滅菌，本試驗(yàn)采用的方法是將基質(zhì)放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌3 h，再冷卻1 d，待氣味散去之后再進(jìn)行移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

污染率隨著消毒時(shí)間的增加而減少，但是褐化率卻幾乎隨著消毒時(shí)間的增加而升高，當(dāng)用4%次氯酸鈉消毒5 min時(shí)，組培苗的成活率最高，因此先用濃度為70%的乙醇對(duì)外植體消毒30 s，再用濃度為4%的次氯酸鈉消毒5 min是最適宜的滅菌方式。

2.2 腋芽誘導(dǎo)

6-BA對(duì)腋芽誘導(dǎo)有很大的影響，結(jié)果見表1。從生長情況來看，經(jīng)過30 d初代培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況有很大區(qū)別，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，叢生芽幾乎糾結(jié)成團(tuán)，變畸形，顏色有些呈深褐色，詳見圖1。當(dāng)6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，叢生芽比較細(xì)弱，還有些玻璃化，顏色較淡。當(dāng) 6-BA 濃度為0.8 mg/L時(shí)，叢生芽長勢(shì)較好，顏色正常，詳見圖2。從各培養(yǎng)基內(nèi)叢生芽的數(shù)量來看，當(dāng)6-BA濃度為 0.8 mg/L 時(shí)，叢生芽數(shù)量最多，平均有12.33個(gè)，誘導(dǎo)率也最高，為61.65%；不添加6-BA的MS培養(yǎng)基中一直都沒有產(chǎn)生叢生芽；而當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，叢生芽的數(shù)量平均只有3.33個(gè)，誘導(dǎo)率僅為16.65%。另外，各培養(yǎng)基內(nèi)叢生芽的數(shù)量隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)也不盡相同，最早產(chǎn)生叢生芽的培養(yǎng)基是MS+0.8 mg/L 6-BA，且叢生芽數(shù)量一直在增加，增加得也最快；最晚產(chǎn)生叢生芽的培養(yǎng)基是MS+2.0 mg/L 6-BA，叢生芽的數(shù)量基本保持不變。綜上可以得出，最適宜的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+0.8 mg/L 6-BA。

表1 不同濃度6-BA對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

2.3 叢生芽增殖

經(jīng)過30 d的繼代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加的6-BA濃度不同，叢生芽增殖的結(jié)果也不同，詳見表2。從叢生芽數(shù)量來看，隨著6-BA濃度的逐漸升高，叢生芽的數(shù)量也在一定范圍內(nèi)逐漸增多，但當(dāng)6-BA濃度過高時(shí)，即MS+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中叢生芽的數(shù)量反而比培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA中的少很多。從組培苗的平均生長量來看，在MS+1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，叢生芽長得最快也最健壯，詳見圖3；在培養(yǎng)基 MS+2.0 mg/L 6-BA上，叢生芽長得很慢，有畸形苗，長勢(shì)最差，詳見圖4。從整體上來看，最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA。另外，在繼代培養(yǎng)時(shí)還發(fā)現(xiàn)，繼代次數(shù)對(duì)叢生芽增殖有一定的影響，在對(duì)柳葉栒子組培苗進(jìn)行了7次繼代后發(fā)現(xiàn)，叢生芽增殖能力最強(qiáng)的是第3、

4次繼代，增殖倍數(shù)分別為8.95、9.25，增殖能力最弱的是第7次繼代，增殖倍數(shù)僅為3.90，第4次繼代的增殖倍數(shù)比第7次的高1倍以上。前4次繼代叢生芽的增殖能力都很強(qiáng)，而在第5次繼代之后，增殖能力逐漸減弱。因此可以看出，繼代的次數(shù)不一定是越多越好，隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗體內(nèi)的激素也會(huì)慢慢積累，從而抑制組培苗增殖。因此在平時(shí)繼代時(shí)，要對(duì)定期繼代的組培苗更換培養(yǎng)基，或者及時(shí)進(jìn)行再次初代培養(yǎng)。

表2 不同濃度6-BA對(duì)叢生芽增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)

由表3可以看出，IBA、NAA及基本培養(yǎng)基的類型都對(duì)組培苗的生根有影響。當(dāng)基本培養(yǎng)基為F時(shí)，NAA對(duì)生根的影響大于IBA，當(dāng)NAA濃度為0.05 mg/L時(shí)，根系長勢(shì)最好。當(dāng)以1/2MS作為基本培養(yǎng)基時(shí)，IBA、NAA對(duì)生根的影響都很大。只考慮IBA的影響時(shí)，當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L時(shí)，生根較早；只考慮NAA濃度的影響時(shí)，當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，根系最粗壯。綜合3個(gè)因素來看，生根率較高、根的長勢(shì)較好的培養(yǎng)基組合是F+0.05 mg/L NAA。

表3 不同培養(yǎng)基組合對(duì)組培苗生根的影響

2.5 煉苗移栽

經(jīng)過煉苗的5個(gè)試驗(yàn)組的成活率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組第1組。在本研究的6種煉苗方式中，只閉瓶煉苗或只有開瓶煉苗的成活率都低于既有閉瓶煉苗過程又有開瓶煉苗過程處理方式的成活率，而其中成活率最高的是先閉瓶煉苗 7 d，再開瓶煉苗4 d處理，成活率為72.58%。由此可以得出以下結(jié)論：(1)組培苗在移栽前需要進(jìn)行煉苗；(2)在煉苗時(shí)要注意對(duì)時(shí)間的控制；(3)煉苗需要開瓶與閉瓶相結(jié)合才能取得理想的效果；(4)對(duì)柳葉栒子組培苗比較適合的煉苗方式是先將其閉瓶煉苗7 d，再將其開瓶煉苗4 d。

在移栽時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)基質(zhì)中只有泥炭土與只有泥炭土與蛭石時(shí)，基質(zhì)的透氣性差，小苗根部容易被淹，成活率極低；當(dāng)基質(zhì)中只有蛭石與珍珠巖時(shí)，基質(zhì)的透氣性雖好，但幾乎不保水，導(dǎo)致小苗逐漸干枯，缺水癥狀嚴(yán)重，成活率也不高；當(dāng)基質(zhì)中泥炭土、蛭石、珍珠巖三者都有時(shí)，成活率較高，詳見圖5，但是如果三者比例不當(dāng)，小苗的長勢(shì)也不是很好。最后，篩選出最適宜柳葉栒子組培苗移栽的基質(zhì)是蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比為2 ∶1 ∶1。

3 結(jié)論與討論

在柳葉栒子腋芽誘導(dǎo)時(shí)期，適宜的培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+1.2 mg/L PPM；在叢生芽增殖時(shí)期，最適宜柳葉栒子繼代增殖的培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA；在生根培養(yǎng)時(shí)，最適宜的生根培養(yǎng)基是F+0.05 mg/L NAA，最佳煉苗方式是先閉瓶煉苗7 d，再開瓶煉苗4 d；最適宜的移栽基質(zhì)是蛭石、泥炭土、珍珠巖體積比=2 ∶1 ∶1，移栽成活率高達(dá)72%以上。在選擇外植體時(shí)，最初用的是柳葉栒子的一年生莖段，最后因?yàn)槲廴痉浅?yán)重而失敗，后來改用柳葉栒子實(shí)生苗作為外植體，進(jìn)行滅菌后成活率較高。植物的不同部位所含菌量不同，采集外植體時(shí)要加以仔細(xì)選擇。繼代次數(shù)對(duì)于柳葉栒子叢生芽增殖有影響，不同植物受繼代次數(shù)的影響也不同。東方百合在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，繼代3次后小苗的分化能力逐漸變?nèi)?，長勢(shì)也逐漸變差[24]。本研究中，在進(jìn)行生根之前先對(duì)組培苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，在這個(gè)過程中只加入植物激素NAA，除了植物激素外，還可以考慮加入一些其他天然添加物，如香蕉泥、番茄泥等天然添加物，以及活性炭和馬鈴薯泥、椰子汁等物質(zhì)，這些天然添加物價(jià)格低廉而且便于獲取，效果會(huì)很明顯，在以后的壯苗培養(yǎng)時(shí)可以適量加入。

通過建立柳葉栒子組培快繁體系來繁殖柳葉栒子，生產(chǎn)周期短，僅為4個(gè)月，而且繁殖速度非?？欤a(chǎn)出來的苗特別多，性狀也一致，可以實(shí)現(xiàn)柳葉栒子的工廠化生產(chǎn)，使得柳葉栒子在不久的將來可以大規(guī)模應(yīng)用于園林中，從而為中國的園林綠化增添一抹亮色。