DNA分子標(biāo)記在無核葡萄育種中的應(yīng)用

王愛玲

分子標(biāo)記（molecular marker）是以生物的某些大分子物質(zhì)（主要指核酸）的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。它們能夠穩(wěn)定遺傳，且遺傳方式簡(jiǎn)單，可以反映生物的個(gè)體和群體特征。DNA分子標(biāo)記是目前發(fā)展最為迅速的一類遺傳標(biāo)記，現(xiàn)已有許多成熟的技術(shù)出現(xiàn)，并在植物遺傳育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

20世紀(jì)60年代以來，分子標(biāo)記技術(shù)作為一種新型的遺傳標(biāo)記在生物的遺傳育種和遺傳研究等方面發(fā)揮了越來越重要的作用。在眾多的DNA分子標(biāo)記中，RAPD技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)一經(jīng)產(chǎn)生即在生物學(xué)研究領(lǐng)域中得到重視和廣泛應(yīng)用。在果樹上，由于其生命周期長(zhǎng)、自交育性低、個(gè)體雜合度高、植株占地面積大等特點(diǎn)，給普通遺傳學(xué)研究帶來了很大困難，因此，對(duì)果樹的遺傳規(guī)律研究采用先進(jìn)的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳研究和早期選擇顯得十分迫切和重要。

1 DNA分子標(biāo)記

1.1 DNA分子標(biāo)記類型 DNA分子標(biāo)記主要包括：DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、序列特異性擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）、擴(kuò)增產(chǎn)物切割多態(tài)性標(biāo)記（CAPs）、抗病基因類似物標(biāo)記（RGA）等，其中葡萄上應(yīng)用最多的是RAPD標(biāo)記。

獲得與目標(biāo)性狀相連鎖的DNA標(biāo)記，通常采用兩種方法，即近等基因系法(NILs)和集群分離分析(BSA)法。由于近等基因系群體的獲得需要多代回交，在育種周期和童期相對(duì)較長(zhǎng)的果樹植物上難以應(yīng)用，而BSA法則直接利用F1分離群體，將目標(biāo)性狀分為2組，每組中各個(gè)體DNA等量混合，形成兩個(gè)除目標(biāo)性狀外遺傳背景相同的DNA池，然后尋找差異DNA片段,再進(jìn)行個(gè)體驗(yàn)證即可獲得，目前BSA法已成為葡萄等果樹重要農(nóng)藝性狀DNA標(biāo)記獲取的主要途徑。

1.2 無核性狀分子標(biāo)記 在葡萄育種過程中，無核性狀一直備受關(guān)注，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在葡萄上的廣泛應(yīng)用，對(duì)無核性等一些重要性狀的分析已不再局限于以往的形態(tài)學(xué)指標(biāo)和同工酶、染色體核型分析等常規(guī)手段，許多研究者開始轉(zhuǎn)向分子標(biāo)記和遺傳圖譜的構(gòu)建，并獲得了一些與無核基因相連鎖的DNA分子標(biāo)記。王躍進(jìn)等利用BSA方法獲得了葡萄無核基因連鎖的RAPD遺傳標(biāo)記UBC269519&UBC269484之后，根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)合成了可用于檢測(cè)無核基因的18 bp特異探針GSLP1，用于檢測(cè)了葡萄無核性狀。Lahogue等通過對(duì)“無核白”的研究，獲得了與無核基因連鎖的RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記,成功地檢測(cè)了葡萄無核基因及其性狀。Scott等首次利用AFLP技術(shù)對(duì)火焰無核的突變體進(jìn)行早期鑒定，獲得了2個(gè)特異性引物。

2 DNA分子標(biāo)記在無核葡萄育種中的應(yīng)用

2.1 無核葡萄育種 無核葡萄原產(chǎn)于中亞，一般在氣候溫暖的地區(qū)都能正常生長(zhǎng)，且結(jié)果良好。目前主要栽培于西亞中亞各國(guó)（如希臘、土耳其、伊朗、伊拉克、敘利亞和阿富汗等）、美國(guó)加州和澳大利亞等。我國(guó)主要分布于新疆的吐魯番、鄯善、哈密和和田地區(qū)，其產(chǎn)量和栽培面積占全國(guó)總量的半數(shù)以上。目前，無核葡萄主要用于制干和鮮食。

無核葡萄是葡萄漿果基本上無核，或帶一點(diǎn)很小而軟的殘核。無核葡萄含糖量高，食用方便，風(fēng)味獨(dú)特，品質(zhì)優(yōu)良。葡萄的無核性狀是葡萄生產(chǎn)中重要的商品特性，世界各國(guó)人們消費(fèi)的趨勢(shì)是無核、大粒，無核葡萄所創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)價(jià)值也占有重要地位。因而，無核葡萄育種一直是葡萄育種的重要方面。

無核葡萄育種主要采用傳統(tǒng)的常規(guī)雜交方式，并借助傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行選擇，這種組合方式和選擇手段，不僅獲得的無核單株率低，而且費(fèi)時(shí)耗力，選擇效果極差。后來，Ramming等人采用無核×無核嶄新的雜交組合方式，結(jié)合胚挽救技術(shù)，獲得了較高的無核株率，而且較常規(guī)傳統(tǒng)技術(shù)至少節(jié)省時(shí)間5年，提高育種效率40倍以上。目前我國(guó)無核葡萄育種還是比較落后的，仍采用傳統(tǒng)育種方法，如北京植物園選育的京早晶。新疆通過營(yíng)養(yǎng)系選種選育的大穗無核白等仍不能滿足生產(chǎn)對(duì)品種多樣性的需要。

2.2 國(guó)內(nèi)DNA分子標(biāo)記在無核葡萄育種中的應(yīng)用 在無核葡萄遺傳標(biāo)記研究上,王躍進(jìn)等采用BSA法對(duì)B72-216×B45-187及其64株雜交后代篩選UBC隨機(jī)10 bp引物100個(gè),發(fā)現(xiàn)UBC-269擴(kuò)增產(chǎn)生的約500 bp多態(tài)性片段與無核主基因之一相連鎖,從而獲得了葡萄無核基因的RAPD標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上,采用細(xì)菌質(zhì)粒M13克隆了該片段并測(cè)序,設(shè)計(jì)合成了用以探測(cè)葡萄無核基因存在與表達(dá)的18 bp特異探針,用它對(duì)獲得標(biāo)記的組合、國(guó)際商品栽培品種、無核×無核組合（G78-47×B52-122）的后代進(jìn)行RAPD擴(kuò)增,結(jié)果表明,凡擁有約590 bp多態(tài)性片段的均為葡萄無核基因的攜帶者和無核性狀的表達(dá)者,因此得到了探測(cè)葡萄無核基因存在與否的RADP標(biāo)記和探針。該RADP標(biāo)記和探針的獲得是葡萄無核基因研究與品種選育分子水平上的重大突破,并首次成功地以該標(biāo)記和探針用于檢測(cè)葡萄無核基因的存在與否,RAPD標(biāo)記可在幼苗期對(duì)育種材料進(jìn)行早期鑒定,RAPD探針可在無核葡萄育種中用作檢測(cè)無核基因存在與否的有效手段。

2.3 國(guó)外DNA分子標(biāo)記在無核葡萄育種中的應(yīng)用 在葡萄無核標(biāo)記研究上,國(guó)外也有人做過探索。以色列的Striem使用160個(gè)引物對(duì)Early Muscat×Flame Seedless的82個(gè)后代進(jìn)行RAPD分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了12個(gè)RADP標(biāo)記與7個(gè)反映葡萄無核性狀的指標(biāo)表現(xiàn)出緊密的連鎖關(guān)系,多元線性回歸系數(shù)為R=0.779；并用其中的7個(gè)標(biāo)記的兩步法淘汰了44%的有核個(gè)體,減少了雜種后代近一半的個(gè)體,提高了育種效率。Lahogue F.等利用以RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記對(duì)歐洲葡萄Sultanina在土質(zhì)肥沃情況下表現(xiàn)無核的情況進(jìn)行研究,得到了與主效顯性基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記 (遺傳距離分別為0.7 cm和3.5 cm),并且把最近的標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記SCC8,所有有核的后代表現(xiàn)為SCC8-/SCC8-,所有無核的后代表現(xiàn)為SCC8+/SCC8+,從而成功地檢測(cè)了葡萄無核基因及其性狀。

無論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外的研究者,他們均對(duì)葡萄無核的遺傳規(guī)律做出了新的、有益的探索,并結(jié)合RADP技術(shù)及其遺傳標(biāo)記對(duì)葡萄無核基因的存在與否進(jìn)行DNA分子水平的檢測(cè),這些工作的開展,無疑推動(dòng)了對(duì)葡萄無核遺傳規(guī)律的認(rèn)識(shí)、無核育種效率的提高。

3 展望

DNA分子標(biāo)記，無論理論還是實(shí)踐都十分有價(jià)值。它使人們對(duì)基本遺傳成分的觀察進(jìn)入了一個(gè)更深的層次,從而使人們對(duì)某些性狀遺傳規(guī)律的分析更加詳實(shí)、更加可靠,親本選配更符合育種目標(biāo)。此外,在了解起源及進(jìn)化關(guān)系、品種鑒別、品種保護(hù)等方面都有很廣闊的應(yīng)用前景。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,連鎖遺傳圖的構(gòu)建已不再是少數(shù)幾種作物的專利,包括多年生果樹(葡萄、蘋果、核果類果樹等)在內(nèi)的不少園藝作物都已擁有各自的分子圖譜。分子標(biāo)記技術(shù)目前最有價(jià)值的實(shí)際應(yīng)用是 “分子標(biāo)記輔助育種”,通過分子標(biāo)記使早期選擇、預(yù)測(cè)成為可能,同時(shí)某些不易區(qū)分的性狀也可以通過遺傳標(biāo)記的間接選擇來達(dá)到目的。對(duì)某些不期望的性狀也能夠及時(shí)地發(fā)現(xiàn)和淘汰。隨著研究手段與技術(shù)的改進(jìn),標(biāo)記的基因?qū)⒈豢寺?、轉(zhuǎn)移到目標(biāo)葡萄品種上,形成新的轉(zhuǎn)基因葡萄品種,特別是在今后獲得一批抗逆或有益于人體健康有關(guān)的特異品種?？梢灶A(yù)料,DNA分子標(biāo)記技術(shù)將在葡萄科研中發(fā)揮越來越重要的作用。

（參考文獻(xiàn)略）