循環(huán)腫瘤DNA在結(jié)直腸癌臨床診療中的應(yīng)用價值研究

楊燕峰，潘琴，王純

溧陽市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇常州 213300

近期國內(nèi)相關(guān)研究表明，結(jié)直腸癌發(fā)病率在我國居所有惡性腫瘤的第三位，且呈逐年上升態(tài)勢；該病致死率高，早期結(jié)直腸癌（Ⅰ、Ⅱ期）患者接受治療，5年存活率為75%～90%，而晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者的5年生存率僅為40%～55%，因此早期發(fā)現(xiàn)、早期治療對于改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后具有顯著積極意義。但CRC并無典型早期癥狀，多數(shù)早期患者僅表現(xiàn)為局部隱痛或大便形狀改變等，至癥狀較為明顯時，多已進展至中晚期。既往臨床多從活檢組織標(biāo)本中獲得腫瘤特異的生物信息，但活檢標(biāo)本系由傾入性操作獲得；而有些學(xué)者通過唾液、尿液等代謝物進行篩查的結(jié)果顯示其敏感性、特異性較差。ctDNA是由腫瘤細胞釋放的DNA片段，可于外周循環(huán)中直接檢測，為CRC的早期診斷提供了可能，基于此，該研究對ctDNA在結(jié)直腸癌臨床診療中的應(yīng)用價值進行探討分析，綜述如下。

1 生物學(xué)特性

ctDNA的來源與釋放機制目前醫(yī)療界尚未達成共識，多數(shù)學(xué)者認為其是由實體腫瘤細胞破裂或凋亡而釋放出的游離基因片段，大小約為0.18～21kb，來源包括循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶，其中凋亡是主要釋放機制，同時也包括分泌、壞死等方式；但釋放水平及速率尚不明確。研究表明[1-2]，ctDNA具有如下生物學(xué)特征：①ctDNA來源于腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶，甚至殘留微小病灶等機體所有荷瘤部位，因而能夠?qū)δ[瘤整體特征進行全面反應(yīng)；②不同類型癌癥患者ctDNA含量基線水平波動較大，同一癌癥患者個體間差異也較為明顯，且其含量水平隨惡化程度及“腫瘤負荷”實時變化，因此較高的ctDNA水平常代表癌癥已進展至晚期或較差的預(yù)后；③ctDNA半衰期較短，在血液循環(huán)中的半衰期＜2 h，因而血中濃度是對機體腫瘤狀態(tài)的實時反映；④因腫瘤細胞有克隆性質(zhì)，因此ctDNA攜帶有特異性的遺傳信息，其核酸序列與腫瘤特異性核酸序列高度一致，分析ctDNA的基因變異類型與數(shù)量，有助于確定對該變異類型敏感的靶向藥物[3]。

2 ctDNA的檢測

2.1 樣本制備

采集血漿、血清均可檢測ctDNA，但血清中雖然有較多數(shù)量及較高純度的DNA，同時其也具有易降解的特征。因而，異?；驒z測的陽性率不夠理想，且若血液凝固后，血細胞將逐步裂解，向血清中釋放正常DNA，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，采用血漿檢測ctDNA是目前臨床最佳取樣方法，血漿處理的過程中，應(yīng)注意將血液置于含有EDTA的抗凝血劑中，離心處理后使用專用試劑盒提取。為提高檢測的準(zhǔn)確性，檢測樣本的采集與提取中的具體事項如下：采新鮮外周血后應(yīng)及時放入含細胞防腐劑和ECTA-K3抗凝血劑的ctDNA BCT試管中；輕柔倒轉(zhuǎn)試管8～10次以保證成分的充分混合；4～37℃下常溫運輸、保存，無需冷凍儲藏。

2.2 檢測方法

定性和定量是目前結(jié)直腸癌患者ctDNA檢測的兩種方向，其目的分別在于確定腫瘤的存在及惡性程度，以二代測序（NGS）為基礎(chǔ)檢測、以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)擴增是目前常用的兩大平臺檢測技術(shù)，其中前者多用于批量基因、外顯子及基因組的ctDNA檢測，具有較高的效率；后者則多用于檢測某一特定基因或數(shù)個基因的ctDNA，在保證特異性的同時具有較好的敏感性。

3 ctDNA在治療中的應(yīng)用

3.1 早期診斷

Tie等[4]研究表明，ctDNA水平檢測在早期篩查、早期診斷中具有重要價值，其研究結(jié)果顯示健康人的血清DNA、CEA水平均顯著低于結(jié)腸癌患者，提示聯(lián)合檢測能夠作為早期篩查指標(biāo)且特異性較高；有學(xué)者在100例健康者與229例行化療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的對比研究中發(fā)現(xiàn)后者的ctDNA水平明顯較高[5]。但對于早期患者而言，血液ctDNA水平檢測目前仍屬于探索階段，僅可作為某些熱點突變的初篩或腫瘤組織檢測的補充，但較高的特異性和能夠避免組織活檢所造成創(chuàng)傷的優(yōu)點顯示了其良好的應(yīng)用前景。

3.2 判斷療效

隨著近年來結(jié)直腸癌治療研究的不斷進展，抗腫瘤藥物呈多樣化態(tài)勢不斷出現(xiàn)，因而如何及時評定治療效果以指導(dǎo)臨床已成為目前腫瘤治療的挑戰(zhàn)之一。既往研究證實，結(jié)直腸癌患者ctDNA濃度及變異特征能夠如實、高效反映腫瘤變化情況，且在評估如腫瘤是否完全切除、某藥物對患者的治療效果方面具有一定價值。閆巍[6]等研究結(jié)果顯示，手術(shù)切除腫瘤3d后結(jié)直腸癌患者的ctDNA水平較術(shù)前有一過性升高，術(shù)后14～30 d的水平則較術(shù)前顯著下降；同時有研究證實結(jié)直腸癌患者術(shù)后ctDNA呈明顯的下降趨勢，而于病情復(fù)發(fā)患者中則可見ctDNA水平的升高。以上研究均提示ctDNA水平及變化情況能夠體現(xiàn)腫瘤進展?fàn)顩r，同時特異性ctDNA的變化與腫瘤負荷存在關(guān)聯(lián)性。

3.3 指導(dǎo)靶向用藥

表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（VGEF）靶點的單克隆抗體藥物是目前已獲得臨床使用批準(zhǔn)的兩類結(jié)直腸癌靶向藥物，其中前者以帕尼單抗、西妥昔單抗為代表，后者以貝伐珠單抗為代表，盡管在2017年的NCCN指南[7]中已不再推薦可切除肺或肝轉(zhuǎn)移瘤的結(jié)腸癌患者在新輔助化療中應(yīng)用靶向藥物，但對需聯(lián)合用藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移化療無效的患者，靶向治療仍為一線或者二線用藥。研究表明[8]，KRAS野生型結(jié)直腸癌患者采用抗EGFR單克隆抗體可獲得顯著的生存獲益，但存在KRAS基因突變或NRAS突變的結(jié)直腸癌患者并不能從使用抗EGFR藥物中獲益；因此在靶向藥物治療前，需對NRAS和KRAS進行檢測，而如使用石蠟包埋的組織這一最為準(zhǔn)確的突變檢測方法，需一黃豆大小體積的組織，但對于已發(fā)生術(shù)前遠處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)遠處轉(zhuǎn)移無法手術(shù)的患者而言，組織獲取較為困難，同時可引起穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥[9]。ctDNA則在組織獲取方面具有顯著優(yōu)勢，僅需采集10 mL的外周血即可完成基因測序，患者易于接受，且可重復(fù)獲取。研究表明[10-11]，不同腫瘤部位、原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶或同一腫塊不同部位的腫瘤細胞基因突變情況具有一定差異性，這種差異性將致使組織標(biāo)本基因檢測結(jié)果的局限性，無法全面反映整體腫瘤細胞的突變情況，從而對靶向治療效果產(chǎn)生一定影響；而ctDNA可由全身腫瘤細胞壞死凋亡后釋放至血液循環(huán)，因此，具有很強地全身腫瘤細胞突變的代表性，因而能夠克服腫瘤的異質(zhì)性，更好的指導(dǎo)靶向用藥。

3.4 評估預(yù)后

大部分結(jié)直腸癌患者治療后，其機體內(nèi)多數(shù)腫瘤細胞由免疫系統(tǒng)吞噬，但仍有新腫瘤灶出現(xiàn)的可能，常規(guī)影像學(xué)方法僅可滿足評價未行手術(shù)切除患者的放療、化療或靶向治療的效果，但因體積的限制，該方法不適用于對于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測。ctDNA最早應(yīng)用于乳腺癌及肺癌的預(yù)后監(jiān)測，其變化情況與腫瘤發(fā)展具有高度一致性；ctDNA較短半衰期的特性使其能夠與實時反映腫瘤變化情況，加之其來源主要為腫瘤細胞，特異性也較高。Diehl等[12]研究結(jié)果顯示，對結(jié)腸癌術(shù)后患者進行連續(xù)ctDNA突變情況檢測能夠很好的監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，其特異度、靈敏度均接近100%。因此，隨著術(shù)后監(jiān)測隨訪時間的延長以及ctDNA研究的日趨深入，可以預(yù)見將有更多更具說服力的研究證實ctDNA在評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后及復(fù)發(fā)中的應(yīng)用價值。

4 小結(jié)

目前ctDNA的檢測和分析方法尚無標(biāo)準(zhǔn)，每種方法的指標(biāo)、適用人群及癌癥類型均不盡相同，但ctDNA作為新型腫瘤標(biāo)志物，具有顯著的微創(chuàng)、操作簡單、可重復(fù)獲取、實時、準(zhǔn)確等優(yōu)點，能夠較好的克服腫瘤異質(zhì)性，已顯示了其在結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用中的廣泛前景。可以預(yù)見，如能克服研究樣本量不足、標(biāo)本無法長期保存等技術(shù)問題，在此基礎(chǔ)上充分結(jié)合影像學(xué)檢查、常規(guī)腫瘤標(biāo)志物與液體活檢技術(shù)，結(jié)直腸癌患者的診療將會更加個體化、精準(zhǔn)化，從而顯著提高生活獲益，改善預(yù)后。