循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及其在前列腺癌中的研究進(jìn)展

王 娟，楊 柳，馬越云 綜述，郝曉柯審校

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安，710032）

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外圍繞循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值展開(kāi)了多項(xiàng)探索性研究。食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了CellSearch檢測(cè)的結(jié)果可作為轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌 的 預(yù) 測(cè) 指 標(biāo)，分 別 以3 個(gè)／7.5 微 千、5 個(gè)／7.5 微 千 和5個(gè)／7.5微千外周血的CTCs為Cutoff值，該值與患者臨床無(wú)進(jìn)展生存期與總生存期相關(guān)。CTCs的檢測(cè)可有效地應(yīng)用于體外早期診斷，指導(dǎo)個(gè)體化治療包括臨床藥物的篩選、耐藥性的檢測(cè)，腫瘤的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)以及腫瘤新藥物的開(kāi)發(fā)等，為動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)患者的治療效果提供了最直接的證據(jù)。本文就循環(huán)腫瘤細(xì)胞現(xiàn)今在腫瘤個(gè)體化治療領(lǐng)域，特別是在前列腺癌個(gè)體化治療中的研究及進(jìn)展做一回顧和總結(jié)。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法

如何從成百上億的血細(xì)胞中尋找CTCs仍然是現(xiàn)在面臨的問(wèn)題，此外由于CTCs的易碎性和異質(zhì)性，也為其分離和檢測(cè)帶來(lái)一定困難，但CTCs檢測(cè)技術(shù)在近半個(gè)世紀(jì)得到飛躍式發(fā)展。

1.1 基于生物學(xué)特性的CTCs分離檢測(cè)技術(shù) 利用細(xì)胞表面特有的標(biāo)志物從大量的血細(xì)胞中對(duì)CTCs進(jìn)行選擇及純化。負(fù)性分選是通過(guò)利用白細(xì)胞表面的特異性分子抗原，篩除白細(xì)胞而留下包括CTCs在內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)一步鑒定。正性分選則是利用上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）進(jìn)行CTCs選擇。但Ep－CAM 的表達(dá)可能在CTCs經(jīng)歷上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的過(guò)程中降低，對(duì)EpCAM 低表達(dá)的CTCs選擇替代的標(biāo)志物標(biāo)記后進(jìn)行捕獲也成為目前研究的熱點(diǎn)之一［1］。

正性分選的方法最具代表性的CellSearch平臺(tái)，可從400多億的血細(xì)胞中檢測(cè)到單個(gè)CTCs，重復(fù)性、特異性和敏感性高。CellSearch平臺(tái)也有不足：在實(shí)際應(yīng)用中，捕獲的腫瘤細(xì)胞由于純度低，利用免疫納米磁顆粒富集時(shí)對(duì)細(xì)胞固定有一定要求，以及CTCs自然降解等原因，對(duì)CTCs進(jìn)行有意義的分子學(xué)分析比較困難。另外，由于CTCs的計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)由于不同操作者對(duì)CTCs的主觀認(rèn)知不同而不一致，該平臺(tái)的技術(shù)要求及結(jié)果判讀也對(duì)操作者的專業(yè)知識(shí)水平提出了更高的要求。所以需要一整套基于分析CTCs形態(tài)學(xué)，包括其細(xì)胞大小、圓度及細(xì)胞凋亡特性等指標(biāo)的自動(dòng)化的計(jì)數(shù)程序，將學(xué)者們的認(rèn)識(shí)標(biāo)準(zhǔn)化，以便客觀定量血液中CTCs［2］?；阝}黏蛋白－11的捕獲技術(shù)可用于鑒定低表達(dá)EpCAM 的CTCs［3］。

其他基于免疫納米磁顆粒捕獲的系統(tǒng)，如AdnaGen系統(tǒng)利用RT－PCR 的方法分析腫瘤原發(fā)灶特異性的基因轉(zhuǎn)錄本［4］，從而分析CTCs的分子表征。MagSweeper系統(tǒng)以磁性棒為分離基礎(chǔ)的分離器，利用磁性棒運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的切變力洗脫血細(xì)胞，利用這種方法分離的細(xì)胞可以有效保證RNA 的質(zhì)量以便進(jìn)一步進(jìn)行多重定量RT－PCR 及單個(gè)CTCs中RNA 測(cè)序。VerIFAST 平臺(tái)利用兩種不相混的液體的高界面能差，確保只有被納米免疫磁顆粒吸附的細(xì)胞能通過(guò)不混溶的液體，以快速分離和篩選CTCs［5］。

馬薩諸塞州總醫(yī)院（MGH）利用細(xì)胞表面抗原的原理研發(fā)了一系列的微流控分選設(shè)備。第一代μpCTCs 芯片通過(guò)78000個(gè)涂覆有抗EpCAM 抗體的微電位點(diǎn)捕獲表達(dá)EpCAM的CTCs；第二代為HBCTCs芯片通過(guò)蝕刻的雙螺旋微流體通道構(gòu)造增加細(xì)胞和涂有抗EpCAM 抗體的通道管壁的接觸時(shí)間；第三代CTCs－芯片技術(shù)（CTCs－iChip）通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)CTCs的純化。利用負(fù)性分選方法富集的CTCs可以進(jìn)行包括研究單個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)的各種分子層面包括對(duì)CTCs進(jìn)行分型研究［6］。

另一些基于正性分選的微流控技術(shù)如NanoVelcro，設(shè)計(jì)有包被抗EpCAM 抗體的納米硅金屬導(dǎo)絲與聚二甲基硅氧烷（PDMS）混沌混合器，利用垂直液流的方式增強(qiáng)與CTCs的接觸［7］。GEDI平臺(tái)幾何級(jí)地增強(qiáng)免疫捕獲差異，通過(guò)微電位點(diǎn)上針對(duì)特異性抗原的抗體，在芯片上通過(guò)監(jiān)測(cè)有效的藥物靶接合實(shí)現(xiàn)預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的目的［8］。

1.2 利用CTCs的其他生物學(xué)特性進(jìn)行富集檢測(cè)技術(shù) 根據(jù)CTCs的其他生物學(xué)特性實(shí)現(xiàn)對(duì)其的分離也是方法之一。這些分離富集方法具有獲取未知的CTCs成分的潛在優(yōu)勢(shì)。例如標(biāo)記CTCs侵襲和分泌的某些特定蛋白。但這些方法建立在CTCs在體外細(xì)胞培養(yǎng)仍存活的基礎(chǔ)上，且這些體外培養(yǎng)條件需要模擬并概括和解釋CTCs的體內(nèi)生物學(xué)行為，所以有一定難度。上皮細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（EPISPOT）通過(guò)對(duì)存活CTCs短期內(nèi)（24～48h）釋放的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以此明確原發(fā)灶相關(guān)的CTCs。同樣，基于細(xì)胞黏附基質(zhì)（CAM）為基礎(chǔ)的Vita－Assay平臺(tái)，利用腫瘤細(xì)胞具有侵襲膠原基質(zhì)傾向的特性，體外分離存活的CTCs，實(shí)現(xiàn)不依賴于EpCAM 的表達(dá)來(lái)識(shí)別的CTCs，并進(jìn)行CTCs計(jì)數(shù)和CTCs相關(guān)的DNA 分析。這些CTCs的分析方法在幾個(gè)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的探索性研究中使用，包括PSMA 免疫細(xì)胞化學(xué)分析EMT 過(guò)程中的標(biāo)志物研究，陣列比較基因組雜交（CGH）和全基因組的甲基化分析［9］。

1.3 基于物理學(xué)特性的CTCs分離檢測(cè)技術(shù) 可以根據(jù)細(xì)胞的密度、大小、可變形性及電負(fù)荷等特征將CTCs與其他的血細(xì)胞之間區(qū)分，分離后的細(xì)胞根據(jù)免疫組化、免疫熒光或PCR進(jìn)一步鑒定。ISET 平臺(tái)通過(guò)直徑8μm 的微孔進(jìn)行血液過(guò)濾，之后對(duì)保留在過(guò)濾器上的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的染色檢查或免疫細(xì)胞化學(xué)分析。分別利用CellSearch與ISET 對(duì)一批前列腺癌患者外周血的CTCs進(jìn)行檢測(cè)比較，發(fā)現(xiàn)兩者只有60%的一致性，提示這兩種細(xì)胞的分離技術(shù)可以識(shí)別CTCs不同的亞群。由于兩個(gè)檢測(cè)平臺(tái)使用不同的指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義不同的CTCs，可能出現(xiàn)不一樣的結(jié)果：使用ISET 平臺(tái)檢測(cè)的CTCs最終由病理學(xué)家根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定，而CellSearch平臺(tái)檢測(cè)方法對(duì)CTCs的最終鑒定則是通過(guò)細(xì)胞角蛋白的免疫熒光強(qiáng)度和DAPI核染色，可見(jiàn)兩個(gè)平臺(tái)各有特色：ISET 可以檢測(cè)出不表達(dá)特異性標(biāo)志物的CTCs而CellSearch可以收集到直徑小于8μm 的CTCs。

介電泳分離基于不同的細(xì)胞存在極化性（即電性能）差異的原理分離CTCs，避免抗體的標(biāo)記，最低限度修飾CTCs，較好保持細(xì)胞活性以便進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)分析［18］。迪安流分餾法（DEF）則是根據(jù)細(xì)胞體積不同［11］，采用螺旋微通道離心的方法將體積較大的CTCs與血細(xì)胞分離，再結(jié)合生物學(xué)檢測(cè)提純獲得CTCs。

1.4 其他創(chuàng)新的CTCs的分離檢測(cè)技術(shù) 新方法的研發(fā)主要集中在如何消除CTCs的生物學(xué)和物理學(xué)的偏差?？赏ㄟ^(guò)RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增特異mRNA 進(jìn)行CTCs檢測(cè)，依賴RT－PCR的方法可以特定檢測(cè)全血有核細(xì)胞群中的前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄子［12］。高通量的光纖陣列掃描技術(shù)（FAST）可將掃描到的每一個(gè)旋涂在顯微鏡載玻片的有核細(xì)胞成像［13］?；诩す鈷呙璧腃TCs計(jì)數(shù)結(jié)合了與顯微鏡成像與流式細(xì)胞技術(shù)可最大化檢測(cè)CTCs，但需要細(xì)胞表達(dá)EpCAM 抗體能被觀測(cè)到。還可將涂覆有EpCAM 抗體的醫(yī)用導(dǎo)線放置到患者的肘靜脈以檢測(cè)外周血CTCs，但只能用已知的標(biāo)志物標(biāo)記CTCs［14］。

2 CTCs的臨床研究進(jìn)展

由于CTCs實(shí)時(shí)反映體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化，可以更準(zhǔn)確地反映病情的發(fā)展，目前常見(jiàn)的熱點(diǎn)基因檢測(cè)幾乎都可以在CTCs上實(shí)現(xiàn)。將捕獲的非小細(xì)胞肺癌患者外周血CTCs進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)T790M 的突變與耐藥相關(guān)，利用濾過(guò)和FA－FISH 技術(shù)檢測(cè)ALK 基因重排可以預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)克唑替尼的療效［15］。對(duì)乳腺癌患者CTCs 進(jìn)行HER－2的表達(dá)檢測(cè)可以指導(dǎo)赫賽汀的用藥。對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的血液標(biāo)本中分離的CTCs，進(jìn)行KRAS、PIK3CA 及BRAF的突變情況檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的預(yù)后［16］。卵巢癌患者的CTCs中發(fā)現(xiàn)ERCC1 表達(dá)陽(yáng)性的患者對(duì)鉑類治療效果不佳［17］。同時(shí)利用CellSearch和IsoFlux捕獲的CTCs也已經(jīng)證實(shí)可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTCs基因分型［18－19］。多重退火和環(huán)化循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)（MALBAC）成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)于來(lái)自癌癥患者外周血單個(gè)CTCs 的全基因組擴(kuò)增和深度測(cè)序［20］。該技術(shù)使得研究人員可以在單個(gè)細(xì)胞水平準(zhǔn)確探測(cè)全基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）和單核苷酸變異（SNVs）［21］。除了CTCs單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)革命，CTCs源性移植瘤模型研究可以保持與原發(fā)腫瘤相同的形態(tài)學(xué)和基因特性，可以穩(wěn)定傳代，為藥物試驗(yàn)及耐藥研究提供了良好的平臺(tái)［22］。

在前列腺癌的CTCs研究過(guò)程中，IMMC－38共招募了276例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者，對(duì)其中的231例進(jìn)行了有效地評(píng)估。該研究利用CellSearch平臺(tái)在治療前后按月對(duì)患者的外周血CTCs進(jìn)行持續(xù)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)以CTCs 5個(gè)／7.5微升外周血為Cutoff值，治療前的CTCs基線水平對(duì)患者中位OS具有預(yù)測(cè)價(jià)值，這項(xiàng)臨床研究最終使得FDA 于2008年批準(zhǔn)了CellSearch平臺(tái)用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的評(píng)估。利用微流體芯片捕獲、RT－PCR 和FISH 技術(shù)檢測(cè)到前列腺癌患者CTCs中TMPRSS2－ERG 基因融合、雄激素受體AR 突變及AR－V7突變［23－24］，往往提示前列腺癌更具侵襲性及對(duì)恩雜魯胺和阿比特龍耐藥。其他CTCs 水平分子特征分析的內(nèi)容還包括PTEN 缺失、擴(kuò)增和MYC的擴(kuò)增，CTCs中Ki－67增殖很大程度上提示前列腺癌患者容易發(fā)生去勢(shì)抵抗，AR 蛋白的改變與臨床對(duì)多西他賽的反應(yīng)相關(guān)，還有對(duì)CTCs細(xì)胞的微管束研究也發(fā)現(xiàn)其與多西他賽化療的療效相關(guān)［8］，這些研究都為前列腺癌的個(gè)體化治療研究提供了方向和線索，當(dāng)然這些結(jié)果還有待更大樣本量的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

CTCs也可用于前列腺癌去勢(shì)抵抗的機(jī)制研究。AR 信號(hào)通路的重新激活是前列腺去勢(shì)抵抗的機(jī)制之一。FISH 檢測(cè)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌CTCs中發(fā)現(xiàn)AR 基因的突變、AR 拷貝數(shù)量改變［13］。HBCTCs芯片利用單細(xì)胞免疫分型動(dòng)態(tài)觀察CTCs到AR 通路的重新激活與前列腺癌耐藥有關(guān)。同時(shí)，在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的CTCs 中也檢測(cè)到多種AR 基因突變，如W741R、V757A、R874Y、T877A。

下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)前列腺癌CTCs的SNVs已經(jīng)證實(shí)與前列腺癌預(yù)后相關(guān)，而SOD2、GPX1、AR、cyclinB 和bFGF等基因的過(guò)表達(dá)與轉(zhuǎn)移相關(guān)［25］。通過(guò)全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)CTCs與原發(fā)腫瘤組織具有較高的一致性，對(duì)一例前列腺癌患者CTCs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)73種突變類型有51種出現(xiàn)在配對(duì)組織中吻合率達(dá)70%。而腫瘤組織中的56 種突變類型有41 種在CTCs中檢出［26］。這意味著CTCs將為認(rèn)識(shí)前列腺的分子生物學(xué)機(jī)制提供新視野。

3 小 結(jié)

CTCs檢測(cè)技術(shù)近幾年在CTCs檢測(cè)敏感性和全面分析能力有了很大的提高。盡管如此，在不同平臺(tái)檢測(cè)的靈敏度和結(jié)果的驗(yàn)證由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)而受到阻礙，這也使得臨床試驗(yàn)隊(duì)列研究中判斷患者的臨床特征受到影響。因此亟待CTCs檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化及認(rèn)識(shí)規(guī)范化。

關(guān)于CTCs的分類依賴于細(xì)胞分離使用的技術(shù)，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)到對(duì)特定的蛋白質(zhì)標(biāo)記（上皮和／或間充質(zhì)），目前仍存在較多的分歧。對(duì)比CellSearch和ISET 平臺(tái)，在ISET 平臺(tái)由病理學(xué)家分離鑒定為CTCs的某些細(xì)胞不能被CellSearch的抗體所識(shí)別。鑒于檢測(cè)步驟的各個(gè)環(huán)節(jié)存在太多的不一致，CTCs檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化平臺(tái)的建立和臨床驗(yàn)證在現(xiàn)階段來(lái)說(shuō)是很難實(shí)現(xiàn)的。而且標(biāo)準(zhǔn)的制定需要病理學(xué)家、生物學(xué)家、臨床醫(yī)生、生物工程專家等各方各面的專業(yè)人士參與。最重要的是國(guó)際上首先需要對(duì)CTCs的形態(tài)學(xué)特征和標(biāo)志物達(dá)成共識(shí)，之后才是對(duì)一些亞型（上皮和／或間充質(zhì)）的CTCs做出分類。事實(shí)上，只有結(jié)合生物工程學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)各學(xué)科的優(yōu)勢(shì)，才能將CTCs檢測(cè)分離技術(shù)最終走向成熟，最終有效成為實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化治療的有力工具。

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