環(huán)狀RNA在人類疾病中的研究進(jìn)展

龍 志，謝 娟，李國(guó)慶

CircRNA與傳統(tǒng)的線性RNA形成方式不同，它是一類主要由一個(gè)以上外顯子通過(guò)特殊的選擇性剪切形成的非編碼RNA[1](non-codingRNA，ncRNA)，呈現(xiàn)首尾相接的封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)70年代，科學(xué)家在RNA病毒中首次發(fā)現(xiàn)circRNA[2]，在后續(xù)的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)circRNA在酵母線粒體、真核生物細(xì)胞和人體轉(zhuǎn)錄本中也大量存在[2-4]。但是，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)的限制和人們認(rèn)識(shí)的不足，circRNA被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的“副產(chǎn)品”而一直被遺忘。最近幾年，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，circRNA開(kāi)始在RNA家族中嶄露頭角，大量的circRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Salzman等人[5]發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種與人類基因表達(dá)相關(guān)的circRNA。Jeck等人[1]在人類成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到了高達(dá)25000余種circRNA。Memczak等[6]則鑒定出1950種人類circRNA、1900余種小鼠circRNA和724種線蟲(chóng)circRNA。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)circRNA可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA、與RNA結(jié)合蛋白相互作用、調(diào)節(jié)mRNAs的穩(wěn)定性、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、參與蛋白質(zhì)翻譯的方式參與調(diào)控生物學(xué)過(guò)程。已有研究表明，circRNA與神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及腫瘤等多種疾病密切相關(guān)。本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究的最新進(jìn)展，就circRNA的種類和形成機(jī)制、生物學(xué)特征、功能、與疾病的關(guān)系以及應(yīng)用前景等做一綜述。

1 環(huán)狀RNA的種類和形成機(jī)制

circRNA分為3類：外顯子來(lái)源的circRNA(ExoniccircularRNA，ecircRNA)[1、6]、內(nèi)含子來(lái)源的RNA(CircularintronicRNA，ciRNA)[8]、外顯子及內(nèi)含子共同來(lái)源的RNA(Exon-introncircularRNA，EIciRNA)[9]。

一般情況下，線性RNA分子的產(chǎn)生主要包括兩個(gè)步驟：首先通過(guò)前體RNA(pre-RNA)剪接去除基因內(nèi)的非編碼內(nèi)含子序列，其次將包含編碼信息的外顯子序列有秩序地連接在一起。而環(huán)狀RNA的形成方式與普通線性RNA的形成方式有所不同，它是由特殊的前體RNA通過(guò)反向剪接的方式產(chǎn)生，其形式包括外顯子環(huán)化(exoncircularization)和內(nèi)含子環(huán)化(introncircularization)兩種類型。

1.1 外顯子來(lái)源的circRNA2013年，Jeck等研究人員[1]提出由外顯子環(huán)化形成的circRNA的兩種形成模型：即套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(lariat-drivencircularization)和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化(intron-pairing-drivencircularization)。套索驅(qū)動(dòng)的環(huán)化是由一個(gè)外顯子的3＇剪接供體(splicedonor)和另一個(gè)外顯子的5＇剪接受體(spliceacceptor)共價(jià)結(jié)合，然后切除內(nèi)含子，再形成circRNA；內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化是通過(guò)ALU互補(bǔ)使兩個(gè)內(nèi)含子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，自身形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后再切除內(nèi)含子而形成circRNA。

1.2 內(nèi)含子來(lái)源的RNA由內(nèi)含子環(huán)化形成的circRNA有兩種產(chǎn)生方式[10]：一種是一個(gè)外源性鳥(niǎo)嘌呤核苷酸攻擊 5＇剪接位點(diǎn)，切除5＇外顯子后連接到內(nèi)含子上，然后，被切除的 5＇外顯子的 3＇羥基末端進(jìn)攻3＇剪接位點(diǎn)，釋放線性內(nèi)含子并連接外顯子，最后，這個(gè)線性內(nèi)含子釋放3＇尾后形成2＇-5＇連接的內(nèi)含子環(huán)狀RNA。另外一種是首先釋放3＇端外顯子，然后內(nèi)含子的2＇羥基末端攻擊5＇剪接位點(diǎn)后產(chǎn)生circRNA。

1.3 外顯子及內(nèi)含子共同來(lái)源的RNAEIciRNA是一類同時(shí)包含外顯子和內(nèi)含子的circRNA，其形成的具體機(jī)制目前研究還不夠透徹。

2 環(huán)狀RNA的生物學(xué)特征

隨著生物信息技術(shù)不斷的發(fā)展以及研究的深入,環(huán)狀RNA的許多生物學(xué)特性被逐漸發(fā)現(xiàn),其中一些重要的特征如下:⑴環(huán)狀RNA廣泛存在于真核細(xì)胞中。包括人、鼠、果蠅、線蟲(chóng)、酵母菌等[11-14]。⑵生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。與傳統(tǒng)的線性RNA相比，環(huán)狀RNA不具備5′→3′極性及3′polyA末端，不易被核酸外切酶RNaseR降解，因此能更加穩(wěn)定地存在于真核細(xì)胞中[1、6]。⑶大部分環(huán)狀RNA由外顯子構(gòu)成，定位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)由內(nèi)含子構(gòu)成，定位于細(xì)胞核中[8]。⑷環(huán)狀RNA具有時(shí)空特異性。在不同的組織中或同一組織不同的發(fā)育時(shí)期，環(huán)狀RNA的種類和表達(dá)量亦千差萬(wàn)別[6-15]。⑸環(huán)狀RNA具有高度物種保守性[1]。⑹絕大多數(shù)環(huán)狀RNA是ncRNA[1]。⑺某些環(huán)狀RNA可以吸附miRNA，能與之相互作用，并且能在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用[8]。

3 環(huán)狀RNA的功能

3.1miRNA海綿 近年來(lái)，有學(xué)者提出競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competingendogenousRNA,ceRNA)假說(shuō)[16]，認(rèn)為具有相同miRNA應(yīng)答元件(miRNAresponseelement，MRE)的RNA分子，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合相同的miRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的靶向調(diào)控。circRNA作為ceRNA家族新發(fā)現(xiàn)的重要成員，本身富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可發(fā)揮“海綿作用”吸附miRNA，降低miRNA對(duì)靶基因的抑制作用，增加靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而起到調(diào)控生物學(xué)過(guò)程的作用[7]。目前，大量研究已經(jīng)證實(shí)CDR1as/ciRS-7、circ-SRY、circ-ITCH、circ-HIPK3、circRNA-ZNF609以及mm9-circ-012559等circRNAs[6,13,17-20]能夠充當(dāng)miRNA分子海綿。例如CDR1as/ciRS-7是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有miRNA分子海綿作用的circRNA，它含有74個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)[21]。circ-SRY含有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn)，能夠在成年小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)[13]。

3.2 與RNA結(jié)合蛋白相互作用RNA結(jié)合蛋白(RNAbindingproteins，RBP)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控RNA(如RNA選擇性剪接，穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯)參與各種細(xì)胞活動(dòng)，例如細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞凋亡、衰老和細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。有研究表明circRNAs能夠吸附如阿格蛋白(Argonaute，AGO)，RNAquaking(QKI)，盲肌(muscleblind，MBL)蛋白，RNA聚合酶II(RNApolymerase II，PolII)，真核起始因子4A-III(EIF4A3)等物質(zhì)，形成穩(wěn)定地的RNA-蛋白復(fù)合物(RNA-proteincomplexes，RPCs)。這些RPCs可以調(diào)節(jié)RBP，然后與線性RNA相互作用[23]。目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)了能夠與RNA結(jié)合蛋白相互作用的某些circRNA，比如circ-Foxo3能夠結(jié)合許多類型的蛋白質(zhì)。它能通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2(CyclinDepedentproteinKinase2，CDK2)等相互作用，進(jìn)而使細(xì)胞增殖周期停滯在G1/S期[24]。

3.3 調(diào)節(jié)mRNAs的穩(wěn)定性 最新的研究發(fā)現(xiàn)某些circRNAs能夠調(diào)節(jié)mRNAs的穩(wěn)定性。例如，CDR1as能夠與mRNA形成復(fù)式結(jié)構(gòu)并維持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[25]。另外，在小鼠的巨噬細(xì)胞中，circ-RasGEF1B能加強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellularcelladhesionmolecule-1，ICAM-1)mRNA的穩(wěn)定性[26]。

3.4 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄circRNAs調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制多種多樣，比如與相關(guān)物質(zhì)作用然后結(jié)合miRNAs。這類circRNAs一般存在與細(xì)胞核。例如，在HeLa和HEK293細(xì)胞核中，作為EIciRNA的circ-EIF3J和circ-PAIP2能夠與U1snRNP結(jié)合，并進(jìn)一步與RNAPoLII作用，從而加強(qiáng)親本基因的表達(dá)[27]。因此，EIciRNA在正反饋調(diào)節(jié)中起到重要的作用?？茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)circ-ankrd52和circ-sirt7在它們的親本基因轉(zhuǎn)錄中也有著同樣的作用[8]。這些研究表明EIciRNAs和circRNAs可能在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，而ecircRNAs則在細(xì)胞質(zhì)中主要發(fā)揮miRNAs海綿功能。

3.5 翻譯生成蛋白質(zhì) 最近，大量研究證實(shí)circRNAs能夠翻譯生成蛋白質(zhì)。LegniniI等人發(fā)現(xiàn)在小鼠成肌細(xì)胞中，具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，IRES)的circ-ZNF609可以翻譯蛋白質(zhì)[28]。PamudurtiN.R.等發(fā)現(xiàn)circMBL3能夠在蒼蠅頭部轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)[29]。在此之前，大多數(shù)研究人員明確表示circRNAs是一種非編碼RNA，但是有研究表明[30-31]某些circRNAs有轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的潛能。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能轉(zhuǎn)錄蛋白的circRNA是HDV，它能產(chǎn)生包含122個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[30]。1998年，Perriman等人[32]發(fā)現(xiàn)，起始密碼子上游具有IRES序列的人造環(huán)狀RNA可以在體外轉(zhuǎn)化功能性綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)。其他研究發(fā)現(xiàn)[31]，在沒(méi)有用于內(nèi)部核糖體進(jìn)入的任何特定元件的情況下，具有多個(gè)FLAG編碼序列的人工合成環(huán)狀RNA可以通過(guò)類似于滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircleamplification，RCA)的機(jī)制翻譯蛋白質(zhì)。

4 與疾病的關(guān)系

4.1CircRNAs與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)circRNAs與阿爾茨海默癥(Alzheimerdisease，AD)、帕金森病(Parkinson,sdisease，PD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在密切聯(lián)系[33-35]。最新的研究顯示circRNAs在人腦組織中高度表達(dá)，并且可能參與調(diào)解突觸功能和神經(jīng)可塑性。Lukiw[33]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦部的海馬CA1區(qū)域存在miR-7-circRNA系統(tǒng)的失調(diào)節(jié)。在AD患者腦組織中，ciRS-7的缺乏導(dǎo)致與之相互作用的miR-7表達(dá)水平上調(diào)，結(jié)果與其相關(guān)的信使RNA靶點(diǎn)及表達(dá)量下調(diào)(如泛素連接酶E2A，ubiquitinconjugaseprotein，UBE2A)。UBE2A是泛素化循環(huán)中的中樞效應(yīng)物，有助于通過(guò)吞噬作用清除淀粉樣多肽，它在AD患者腦組織中含量較低，能促進(jìn)淀粉樣蛋白的生成，這可能是AD的發(fā)病機(jī)制之一。α-突觸核蛋白(Alpha-synuclein)是miR-7的靶基因，其過(guò)度表達(dá)參與到PD的發(fā)生發(fā)展中，miR-7-ciRS-7相互作用可能與PD有關(guān)[34]。Szabo[36]發(fā)現(xiàn)幾個(gè)circRNA，它們?cè)醋耘c異常神經(jīng)發(fā)育表型有遺傳關(guān)系的基因位點(diǎn)，如FBXW7，DOPEY2和RMST。此外，Armakola等人[35]發(fā)現(xiàn)在某些形式的散發(fā)型ALS病例中發(fā)現(xiàn)RBP反式激活應(yīng)答DNA結(jié)合蛋白-43(transactiveresponseDNAbindingprotein43000,TDP-43)在細(xì)胞質(zhì)中逐漸累積，敲低脫支酶1(debranchingenzyme1)活性能引起的內(nèi)含子片段的細(xì)胞質(zhì)增加，這對(duì)于抑制人神經(jīng)元細(xì)胞系和原代大鼠神經(jīng)元中的TDP-43毒性是有效的，這表明使用circRNAs作為ALS潛在治療手段的可能性。

4.2CircRNAs與心血管系統(tǒng)疾病cANRIL是第一個(gè)確定的、與常見(jiàn)的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphisms，SNPs)相關(guān)聯(lián)的circRNA之一，其表達(dá)受到人類INK4a/ARF轉(zhuǎn)錄本調(diào)控，而cANRIL的剪接受影響又會(huì)抑制INK4a/ARF位點(diǎn)，這與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[37]。有趣的是，缺氧是動(dòng)脈粥樣硬化的已知危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是血管生成的關(guān)鍵刺激因子，并且可能與circRNA的重要調(diào)節(jié)有關(guān)。Boeckel等人[38]的研究為此提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中，缺氧能夠調(diào)節(jié)CircRNAcZNF292的表達(dá)，而circRNAcZNF292又能控制血管再生。研究發(fā)現(xiàn)某些circRNAs在人類心臟組織中高度表達(dá)，并與一些關(guān)鍵的心肌基因(如Titin、RYR2和DMD)相關(guān)[39]。Jakobi等人[40]的進(jìn)一步研究為circRNAs在心血管疾病中的作用提供了有力的證據(jù)，他們選取成年小鼠心肌細(xì)胞為材料進(jìn)行RNA測(cè)序，進(jìn)一步確定了575個(gè)候選的心臟circRNAs。更重要的是，在患者的外周血樣品中已經(jīng)檢測(cè)出相關(guān)circRNAs，與健康的人對(duì)照發(fā)現(xiàn)，這些患者的hsacirc_0124644顯著上調(diào)[41]。

4.3CircRNAs與糖尿病 糖尿病與人們長(zhǎng)期的健康密切相關(guān)，長(zhǎng)期的高血糖會(huì)引發(fā)全身多種組織或器官(包括心臟、腎臟、神經(jīng)及血管等)的病變，因此，早期的診斷和更好的治療方法顯得尤為重要。研究人員已發(fā)現(xiàn)miR-7在患有糖尿病的轉(zhuǎn)基因小鼠胰島β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，通過(guò)降低胰島素分泌水平和影響β細(xì)胞的去分化功能，從而導(dǎo)致糖尿病。同樣，在胰島β細(xì)胞中，ciRS-7的過(guò)表達(dá)能夠阻止miR-7的功能，從而提高胰島素分泌水平，他們又從生物信息學(xué)分析篩選出了miR-7潛在的基因靶點(diǎn)，包括Myrip(調(diào)節(jié)胰島素顆粒分泌)和Pax6(增強(qiáng)胰島素轉(zhuǎn)錄)，ciRS-7/miR-7通路通過(guò)對(duì)這兩個(gè)基因靶點(diǎn)的作用，可能提高胰島素分泌水平，這有望成為治療糖尿病的新手段[42]。

4.4CircRNAs與腫瘤 腫瘤威脅著全人類的生命健康，早期的檢測(cè)能提高腫瘤的治愈率。最近的研究表明，circRNAs參與到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，它可能作為某些腫瘤的生物標(biāo)志物并對(duì)腫瘤的診斷起到支持作用。研究發(fā)現(xiàn)has-circ-0000190是診斷胃癌的潛在生物學(xué)標(biāo)記物，與正常人對(duì)照發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者的血漿和胃癌組織中，has-circ-0000190表達(dá)下調(diào)，而且相對(duì)于兩種經(jīng)典的胃癌標(biāo)記物CEA和CA19-9，has-circ-0000190更具敏感性和特異性[43]。Bachmayr-Heyda等人[44]取結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁組織研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)的circRNAs大部分都下調(diào)，隨機(jī)選取5種circRNAs做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，其中4種下調(diào)。類似地，與正常結(jié)腸組織相比較，cirITCH在結(jié)腸癌組織中表達(dá)也下調(diào)，cirITCH可通過(guò)miRNA海綿功能增加ITCH的表達(dá)水平，而ITCH基因參與Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑，其與結(jié)腸癌的發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)，這提示我們cirITCH有可能成為診斷結(jié)腸癌的新型標(biāo)記物[45]。在其他腫瘤如肺癌[46-47]、膀胱癌[48]等研究方面，人們也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)具有意義的circRNAs，例如，人們?cè)谘芯糠伟┑陌l(fā)生發(fā)展機(jī)制時(shí)注意到，與癌旁組織相比，circ-ITCH呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)的趨勢(shì)[46]，circRNA100876與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肺癌的分期相關(guān)[47]。在膀胱癌組織中，circFAM169A和circTRIM24表達(dá)上調(diào)，而另外四種則下調(diào)，分別是circTCF25，circZFR，circPTK2和circBC048201[48]。

5 circRNAs的應(yīng)用前景

CircRNAs作為非編碼RNA家族的新成員，正吸引著越來(lái)越多人的注意。生物學(xué)信息技術(shù)的飛速發(fā)展將人們帶入circRNAs的世界，人們對(duì)circRNAs的認(rèn)識(shí)正在不斷深入。CircRNAs具有高穩(wěn)定性、高保守性及組織特異性等生物學(xué)特性，其充當(dāng)miRNA分子海綿、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、與RBP相互作用等功能逐漸被人們所認(rèn)知，它在人類疾病中的作用機(jī)制也成為研究的熱點(diǎn)，這些都提示我們circRNAs具有廣闊的應(yīng)用前景，它極有可能成為新型的臨床診斷標(biāo)志物，同時(shí)，也為人們發(fā)現(xiàn)新的疾病預(yù)防和治療方法以及新的靶向藥物提供了方向。

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