克柔念珠菌的耐藥機(jī)制及抗真菌對(duì)策研究進(jìn)展

劉然

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100026）

0 引言

在臨床實(shí)踐過程中，常出現(xiàn)的會(huì)引發(fā)感染的念珠菌種類達(dá)17種之多，白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌就是最為常見的幾類致病菌，超過90%的感染由這幾類念珠菌導(dǎo)致?？拐婢幬锏氖褂檬桥R床常見的治療方式，但此類藥物的長期大量應(yīng)用會(huì)引發(fā)念珠菌耐藥性的產(chǎn)生。其中對(duì)氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥率最高，已經(jīng)成為臨床上最為難治的念珠菌，對(duì)患者生命構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。對(duì)克柔念珠菌的耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制以及相應(yīng)治療藥物的進(jìn)一步研究已成為醫(yī)學(xué)界各方關(guān)注的重點(diǎn)。針對(duì)此，從克柔念珠菌的感染和耐藥現(xiàn)狀、耐藥性產(chǎn)生機(jī)理和相關(guān)臨床診治策略等不同方面進(jìn)行了詳盡闡述。

1 克柔念珠菌的感染及耐藥現(xiàn)狀

在國內(nèi)，因標(biāo)本來源、時(shí)間、地區(qū)及氣候的不同，各個(gè)醫(yī)院的克柔念珠菌的分離率從1.4%-8.86%不等[1-9]，對(duì)氟康唑、伊曲康唑的耐藥率從27.78%-100%不等[1-9]，對(duì)唑類藥物耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。臺(tái)灣地區(qū)克柔念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率相比較2010年從2.2%上升到2.8%，對(duì)伏立康唑的耐藥率從0.3%上升至0.5%[10]，在另一項(xiàng)美國研究顯示，克柔念珠菌對(duì)棘白菌素類藥物耐藥率在2008年僅為4.2%，至2014年，其耐藥率已升為7.8%[11]。

2 克柔念珠菌的耐藥機(jī)制

2.1 對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制

羊毛甾醇14α-去甲基化酶（14α-demythylase，14-DM）是唑類藥物耐藥機(jī)制中的作用靶酶，該酶是由ERG11基因編碼產(chǎn)生的，編碼蛋白ERG11p，在麥角甾醇生物的合成過程中處于關(guān)鍵位置，是真菌細(xì)胞膜的主要甾醇成分，經(jīng)由和14-DM結(jié)合，唑類藥物抑制了其生物活性，導(dǎo)致甾醇中間產(chǎn)物的堆積，阻礙麥角固醇的合成，最終使念珠球菌的胞膜結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，最終產(chǎn)生抗藥性。克柔念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制可能由以下幾種引起。

2.1.1 藥物靶酶ERG11編碼基因的突變和過度表達(dá)

克柔念珠菌的ERG11基因大小為1587bp，耐藥株克柔念珠菌中ERG11的mRNA表達(dá)增多，和耐藥性呈正相關(guān)。ERG11基因的突變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化，最終造成其功能差異，降低和唑類藥物間的親合力，出現(xiàn)耐藥性。相關(guān)研究結(jié)果提示，ERG11基因上G487T（A114S）和T916C（Y257H）的錯(cuò)義突變和唑類耐藥相關(guān)[12]。有研究[13]提到，Upc2p在調(diào)節(jié)麥角固醇的代謝中起到了重要作用，可以對(duì)外排泵的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。Upc2p中G648D和A643T的功能性突變，均可造成某一丙氨酸結(jié)構(gòu)改變，變?yōu)樘K氨酸，刺激ERG11的過度表達(dá)，提高菌株耐藥性[14]。在唑類耐藥的臨床分離株中，已報(bào)道ERG11p中至少有60個(gè)氨基酸被取代[12]。

2.1.2 靶位拷貝數(shù)的增多

有關(guān)研究提示，當(dāng)唑類耐藥株中的ERG11基因出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的情況，就會(huì)導(dǎo)致有絲分裂重組、基因突變和等臂染色體形成等情況出現(xiàn)，最終提高對(duì)唑類藥物耐藥性發(fā)生的幾率[15]。

2.1.3 通過藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和減少攝取，而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度

真菌中可導(dǎo)致唑類耐藥的外排泵主要包括兩類，分別是ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如CaCdr1和CaCdr2）和主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（MFS）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如CaMdr1），前者轉(zhuǎn)運(yùn)藥物使用的能量來源于ATP的水解，后者利用細(xì)胞質(zhì)膜電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)底物。在克柔念珠菌中，菌株應(yīng)對(duì)唑類藥物暴露時(shí)，ABC1會(huì)被強(qiáng)力上調(diào)，因此它在天然耐藥方面，可能發(fā)揮了重要作用[16]。臨床上已經(jīng)從暴露于唑類抗真菌藥物患者連續(xù)分離的菌株中證實(shí)，多因素耐藥的逐步發(fā)展與藥物暴露、CDR和（或）MDR基因表達(dá)[17]以及其他機(jī)制（如ERG11過表達(dá)）有關(guān)。

2.1.4 其他的麥角固醇的生物合成途徑成分的修飾

ERG3基因編碼固醇Δ5,6-去飽和酶，有助于固醇的生物合成。相關(guān)研究結(jié)果顯示[18]，把克柔念珠菌至于內(nèi)含伊曲康唑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)麥角固醇含量減少，14-甲基3,6-二醇含量增多，細(xì)胞生長停滯的情況。而提高培養(yǎng)基中氯康唑濃度，則會(huì)發(fā)生14-去甲基糞甾醇蓄積的情況，據(jù)此，我們推測甾醇ERG3在克柔念珠菌耐氟康唑機(jī)制中起到了重要影響。

2.1.5 生物膜和持留細(xì)胞

生物膜是微生物自然生長最普遍的形式之一，其特性是抵抗常用抗真菌藥物。在生物膜里，藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CDR和MDR在生物膜形成過程中被上調(diào)[19]。持留細(xì)胞生長速度不如正常生物被膜細(xì)胞，通過“休眠-生長-增殖”應(yīng)對(duì)逆境的脅迫[20]，能夠在高濃度抗菌藥物下存活并且形成菌落[21]。

2.2 對(duì)多烯類藥物的耐藥機(jī)制

2.2.1 細(xì)胞壁組分發(fā)生變化

以細(xì)胞壁與膜作用為基礎(chǔ)，兩性霉素B對(duì)克柔念珠菌的指數(shù)生長期進(jìn)行了抑制，而細(xì)胞壁內(nèi)葡聚糖的水平改變最終導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。當(dāng)真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量降低時(shí)耐藥性產(chǎn)生[22]。

2.2.2 交叉耐藥

經(jīng)由和真菌細(xì)胞膜表面的麥角固醇相互結(jié)合，多烯類藥物讓細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多微孔，細(xì)胞膜完整性受損，膜內(nèi)重要組成物質(zhì)外泄，真菌死亡。然而，若真菌抗唑類藥物耐藥性出現(xiàn)，真菌細(xì)胞就會(huì)失去合成麥角固醇的能力，最終讓兩性霉素B的抗菌活性消失。所以唑類藥物與多烯類藥物間存在交叉耐藥[23]。

2.3 對(duì)丙烯胺類藥物的耐藥機(jī)制

利用對(duì)角鯊烯環(huán)氧化酶的抑制作用，丙烯胺類藥物擾亂了真菌甾醇的合成進(jìn)程，造成角鯊烯的細(xì)胞內(nèi)堆積，引起真菌的脂質(zhì)代謝紊亂，最終起到抗真菌的效果[24]。現(xiàn)階段見報(bào)的與丙烯胺類藥物耐藥性有關(guān)的研究不多,但在臨床應(yīng)用過程中，耐特比萘芬的毛孢子菌屬(T richophyton rubrum)已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)此類耐藥株中所蘊(yùn)含的角鯊烯環(huán)氧化酶進(jìn)行編碼基因的序列解析,研究結(jié)果提示所有菌株都含有1個(gè)氨基酸突變L 393F。

2.4 對(duì)氟胞嘧啶類藥物的耐藥機(jī)制

耐氟胞嘧啶類藥物的耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理常是因特定的氨基酸被替換最終造成前體藥物的吸收及修飾過程產(chǎn)生變化，最終出現(xiàn)耐藥性[25]。還有研究顯示，其耐藥性可能和胞嘧啶透酶、胞嘧啶脫氨酶缺陷或胸苷酸合酶活性變化有關(guān)。

2.5 對(duì)棘白菌素類藥物的耐藥機(jī)制

有研究[26]提出棘白菌素的耐藥機(jī)制一般與以下幾類因素有緊密聯(lián)系：①FKS1基因突變。②細(xì)胞膜表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sbe2P過度表達(dá)。③藥物過度外排。在這之中，F(xiàn)KS1基因突變的影響已獲得了普遍認(rèn)可。Kahn等[27]的研究結(jié)果提示因FKS1中T2080K發(fā)生雜合突變，讓Phe655→Cys失去了靶酶Fks1p亞單元內(nèi)的(1，3)β-D葡聚糖合成，最終造成了克柔念珠菌抗棘白菌素的耐藥性產(chǎn)生。

3 抗克柔念珠菌對(duì)策的研究進(jìn)展

3.1 建立標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)[28]

近20年來，伴隨藥敏試驗(yàn)方式的持續(xù)完善，抗真菌藥物的敏感性結(jié)果的真實(shí)性更為可信。但也因患者免疫狀態(tài)的不同，基礎(chǔ)疾病的差異，藥物間相互影響，抗真菌藥物劑量高低區(qū)別，療程長短和血藥濃度水平高低的不同，和別種感染因素的影響，如膿腫引流狀況，插入導(dǎo)管是否去除等因素造成藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療情況不符。這就需要我們判斷真菌藥敏結(jié)果要慎重，在將其他會(huì)對(duì)治療效果產(chǎn)生不利影響的因素排除后，將最初致感染菌提取出來，同時(shí)和治療失敗后分離出的真菌的MIC進(jìn)行比較，若其MIC顯著提升，則顯示其耐藥性提高。

3.2 新藥研發(fā)

3.2.1 嗜鉻粒蛋白A(CGA)-N46

CGA是分布于內(nèi)分泌細(xì)胞嗜鉻顆粒和神經(jīng)細(xì)胞中的一種可溶性蛋白[29]。經(jīng)過對(duì)CGA中不同衍生片段的抗菌活性進(jìn)行檢測，結(jié)果提示CGA N端的CGA-46顯示出極強(qiáng)的抗真菌活性[30]。CGA-N46能對(duì)進(jìn)行測試的念珠菌屬的生長進(jìn)行抑制，在這之中，克柔念珠菌的敏感性最強(qiáng)。利用暫時(shí)對(duì)磷脂膜的穩(wěn)定性進(jìn)行去除，造成線粒體功能障礙，同時(shí)抑制DNA合成，CGA-N46被認(rèn)為是抗克柔念珠菌感染的最新化合物[31]。

3.2.2 銀納米顆粒（AgNP）

AgNPs指利用環(huán)保方式，將半胱氨酸視作還原劑合成產(chǎn)生的。在某些學(xué)者的認(rèn)知中，AgNP可被視為開發(fā)新型抗真菌劑的最新化合物，它在成纖維細(xì)胞中具有最低的細(xì)胞毒性，同時(shí)針對(duì)具有抗常規(guī)真菌化合物抗性的念珠菌屬有較強(qiáng)致死性。這就是此類藥物的新藥研究的潛力體現(xiàn)[32]。

3.2.3 羧甲基殼聚糖（CM-殼聚糖）

Tan[33]等通過深刻研究，顯示CM-殼聚糖不論是針對(duì)單個(gè)和混合物中生物膜的非白色念珠菌，均具有顯著抑制作用，常見菌屬包括了熱帶假絲酵母，近平滑假絲酵母，還包括了克柔假絲酵母以及光滑念珠菌。所以CM-殼聚糖不單單可以起到減低念珠菌細(xì)胞代謝活性的作用，還可以刺激生物膜的建立和發(fā)展，在進(jìn)行新藥物研究中極具價(jià)值。

3.2.4 艾沙康唑

艾沙康唑有可預(yù)測的和與劑量成正比的藥動(dòng)學(xué)，現(xiàn)已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，一般被用來治療侵襲性念珠菌病、念珠菌血癥，還可被用于治療侵襲性曲霉病和較為少見的曲霉感染[34]。在艾莎康唑的分子結(jié)構(gòu)式中，其側(cè)鏈具有很高的真菌CYP51蛋白親和力，造成其抗真菌譜范圍更廣，甚至將對(duì)別種唑類抗真菌藥所耐受的真菌也囊括其中[34]。

3.2.5 阿巴康唑

阿巴康唑是一種生物利用度高、抗真菌活性強(qiáng)的口服制劑，針對(duì)足廯已完成Ⅰ期試驗(yàn)評(píng)價(jià)，用于腳趾甲真菌病治療已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)[35]。

3.2.6 福司氟康唑

福司氟康唑是氟康唑的磷酸酯前體藥物，是以氟康唑?yàn)槠鹗荚贤ㄟ^兩部合成。福司氟康唑靜脈給藥2-3d即可達(dá)到有效血藥濃度。安全性好，不良反應(yīng)小[36]。

3.3 聯(lián)合用藥

相關(guān)動(dòng)物結(jié)果提示，小檗堿及黃芩素能有效提升唑類藥物的抗真菌效應(yīng)[37]。王維欣等[38]研究表明，沒食子酸與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥克柔念珠菌的浮游菌表現(xiàn)出體外協(xié)同抗真菌作用。有些研究結(jié)果顯示[39]，枸櫞酸托瑞米芬具有明顯提升卡泊芬凈及兩性霉素B體內(nèi)外抗生物被膜活性的作用。

3.4 老藥新劑型

兩性霉素B脂質(zhì)體是兩性霉素B的一種新劑型，發(fā)揮其最強(qiáng)殺菌效能的同時(shí)降低其毒副作用[26]。20世紀(jì)90年代，研發(fā)了3種不同的兩性霉素B的脂類復(fù)合體，分別是兩性霉素B脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體和兩性霉素B膠狀分散體。制霉菌素脂質(zhì)體是游離制霉菌素包裹在多層脂質(zhì)中，保留其抗菌活性的同時(shí)降低其腎毒性?；尹S霉素的卵磷脂脂質(zhì)體也于20世紀(jì)90年代研發(fā)，其肝毒性大大低于常規(guī)灰黃霉素口服劑。

3.5 抗真菌中草藥

中草藥因其所具備的來源多、抗菌譜廣、毒性小、耐藥性產(chǎn)生率低等優(yōu)勢引起了多方關(guān)注。有研究提示，大蒜、地錦草、黃芩、魚腥草等都具備較高的抗真菌性[40]。還有研究對(duì)這一輪點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步肯定[41]，研究顯示大蒜素可有效抑制生物膜的黏附和胞外多糖的產(chǎn)生；苦參堿則能夠顯著阻礙白念珠菌的黏附和菌絲生長；黃芪苷可抑制真菌DNA的合成而達(dá)到抗菌作用。

4 小結(jié)

克柔念珠菌的耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果，不同耐藥機(jī)制的結(jié)合也形成了其對(duì)氟康唑的天然耐藥。在上文中所提及的耐藥機(jī)制仍待我們的深層次研究，也許會(huì)有未發(fā)現(xiàn)的耐用機(jī)制亟待進(jìn)一步闡明，從而為研制新的抗真菌藥物提供新思路，也可以為臨床合理使用抗真菌藥物提供理論依據(jù)。