抗菌肽在母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用及作用機(jī)制

問(wèn)鑫　高鳳仙

摘要：抗菌肽作為抗生素替代品的首選，得到了大量的研究。本文詳細(xì)的綜述了抗菌肽殺菌的作用機(jī)理，分別闡述了抗菌肽的作用機(jī)制及對(duì)母豬生產(chǎn)性能的影響。

關(guān)鍵字：抗菌肽；作用機(jī)理；膜損傷；母豬；生產(chǎn)性能

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是指在外界條件作用的刺激下由特定的基因編碼、由核糖體合成的一類可抵御外界微生物侵害、清除體內(nèi)抗微生物的小分子陽(yáng)離子多肽，是動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子。本文綜述了抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化特性、作用機(jī)制及其在母豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)

目前，已分離或預(yù)測(cè)出的抗菌肽超過(guò)1200種，但大部分抗菌肽只包含50或更少的氨基酸殘基，最短的抗菌肽僅有6個(gè)殘基，分子量較小。其N端含有賴氨酸、精氨酸等親水性氨基酸殘基，C端則富含丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸等疏水性氨基酸殘基，這使得抗菌肽有水脂兩親性結(jié)構(gòu)；同時(shí)，可賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸通常會(huì)使抗菌肽等電點(diǎn)大于7，表現(xiàn)出一定的陽(yáng)離子特征，可與兩性分子或電負(fù)性細(xì)胞膜結(jié)合，與細(xì)菌的細(xì)胞膜發(fā)生作用?？咕牡闹虚g部分含有大量的脯氨酸和二硫鍵，由此易形成α-螺旋、β-折疊、伸展片層結(jié)構(gòu)和環(huán)形等與其抗菌活性密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)。

作為抗生素替代物的首選?？咕木哂幸韵绿攸c(diǎn)：（1）廣譜抗菌活性：抗菌肽不僅能殺滅革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)，并對(duì)腫瘤和癌細(xì)胞有一定的殺傷作用：（2）熱穩(wěn)定性：抗菌肽具有較強(qiáng)的耐熱性，在沸水中30min仍可保持較高的抗菌活性，可耐受飼料制粒的高溫過(guò)程：（3）高效性：抗菌肽對(duì)病原微生物的最小抑菌濃度（MIC）僅為0.1～10μg/ml，并且可在極短的時(shí)間內(nèi)殺滅所有病原體：（4）特異性：盡管抗菌肽是動(dòng)物先天性防御系統(tǒng)的產(chǎn)物，但是具有特異性，只對(duì)原核生物細(xì)胞和病變的真核細(xì)胞產(chǎn)生作用，對(duì)其他微生物和健康的真核細(xì)胞無(wú)殺傷作用；（5）抗水解：有些抗菌肽可抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶的水解，使其可在動(dòng)物體內(nèi)完整的發(fā)揮作用。此外，抗菌肽還有水溶性好、不殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。

2抗菌肽對(duì)母豬的影響及其作用機(jī)理

隨著近年來(lái)養(yǎng)豬生產(chǎn)的集約化、規(guī)?；?，養(yǎng)殖戶將大量精力放在了提高生長(zhǎng)和產(chǎn)肉性能等方面上，使母豬長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)中，引起母豬的內(nèi)分泌機(jī)能失調(diào)、食欲不振、體脂含量降低等應(yīng)激反應(yīng)，并加劇了母豬泌乳障礙，直接影響了仔豬的成活率和生長(zhǎng)性能，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。作為抗生素替代品的首選，將抗菌肽加入母豬日糧中，可提高母豬的生產(chǎn)性能。

2.1抑殺影響母豬生產(chǎn)的病毒

豬呼吸與繁殖綜合癥（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒?。≒CV-2）是影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的兩個(gè)巨大障礙，其可使豬群生產(chǎn)性能下降，母豬流產(chǎn)增多。萬(wàn)小平等（2011）采用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2加入后備母豬日糧中，研究發(fā)現(xiàn)，融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2可有效減少體內(nèi)PCV-2、PRRSV的帶毒率；處理后備母豬血液PCV-2、PRRSV病毒含量也明顯減少。顯示飼喂融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2產(chǎn)生了良好的抑制及清除病毒的作用，對(duì)降低后備母豬體內(nèi)PCV-2、PRRSV帶毒率有明顯成效。說(shuō)明抗菌肽具有防治常見(jiàn)疾病的前景。此外，有研究表明，抗菌肽對(duì)提高豬瘟抗體水平，改善抗體均勻度方面具有十分顯著的效果，充分驗(yàn)證了抗菌肽對(duì)調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫機(jī)能、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力方面的作用。

其增強(qiáng)母豬免疫力的主要機(jī)理為：抗菌肽可抑制病毒DNA合成的過(guò)程，還可通過(guò)阻礙其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，間接的抑制病毒蛋白質(zhì)合成。王軍和龐廣昌（2005）報(bào)道，抗菌肽Attacin可干擾大腸桿菌的膜蛋白轉(zhuǎn)錄，阻礙蛋白質(zhì)合成，從而增加細(xì)胞膜的通透性。殺滅細(xì)菌。抗菌肽Indolicidin可通過(guò)與脂多糖的相互結(jié)合，達(dá)到抑制蛋白質(zhì)合成的效果。ZHOU和CHEN（2011）研究了抗菌肽apidaecins的亞型apidaecin IB與大腸桿菌膜蛋白的作用。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入apidaecin IB，可使維持膜脂平衡的ftsH過(guò)量分泌。阻礙了膜蛋白合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，抑制其合成。Yenugu等（2004）報(bào)道，抗菌肽HE2的幾個(gè)亞型（HE2al-pha、HE2betal和HE2beta2）不但可與大腸桿菌細(xì)胞膜作用使胞內(nèi)物質(zhì)泄露，還可抑制其DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。

劉立偉和鄧?yán)冢?012）報(bào)道，抗菌肽能刺激細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的物質(zhì)如鈣離子和蛋白酶排入細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C，通過(guò)一系列酶促反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有些抗菌素如thanatin、histatin還可抑制細(xì)胞呼吸作用。進(jìn)而抑殺細(xì)菌。此外，LIU等（2013）采用包含誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽LL-37的穿梭載體，研究大腸桿菌要有氧或無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)狀況，研究發(fā)現(xiàn)。LL-37會(huì)使大腸桿菌生長(zhǎng)受阻，使細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榻z狀；同時(shí)，LL-37不僅可提高其在細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量，在有氧條件下引起致死膜去極化，增加胞膜的通透性，并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)LL-37可通過(guò)阻礙氧化磷酸化相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞糖代謝和能量轉(zhuǎn)化的過(guò)程以及細(xì)胞內(nèi)離子的氧化還原狀態(tài)。由此提出了一種新的靶向能量代謝的AMPs受體介導(dǎo)的殺菌機(jī)制。

2.2降低母豬死產(chǎn)率，提高仔豬成活率

皮燦輝等（2008a）用抗菌肽替代豬場(chǎng)使用的抗生素飼喂母豬和其所產(chǎn)仔豬，并對(duì)508頭母豬和它們分娩產(chǎn)生的5245頭豬仔進(jìn)行追蹤統(tǒng)計(jì)并記錄其健康狀況。結(jié)果表明，試驗(yàn)組木乃伊死胎率僅為0.31%，比對(duì)照組（7.15%）降低了22倍。在哺乳階段，未使用抗菌肽飼料添加劑的對(duì)照組死亡率（2.36%）是試驗(yàn)組（0.35%）的7倍。在保育階段，未使用抗菌肽飼料添加劑的對(duì)照組死亡率（3.76%）是試驗(yàn)組（1.32%）的3倍。潘行正等（2010）研究了抗菌肽對(duì)減少母豬死胎率的效果，結(jié)果表明，添加抗菌肽制劑的母豬試驗(yàn)組死產(chǎn)率為5.77%，按日常用藥方案使用抗生素的對(duì)照組死產(chǎn)率為12.75%：其中試驗(yàn)組木乃伊胎的死產(chǎn)率僅為0.31%。對(duì)照組卻達(dá)到7.16%。添加抗菌肽制劑的試驗(yàn)組仔豬在哺乳期和保育期的死亡率分別為0.34%、1.31%，同期對(duì)照組分別為2.35%、3.65%；對(duì)照組死亡率顯著高于試驗(yàn)組?？梢?jiàn)抗菌肽制劑能顯著降低母豬的死產(chǎn)率與提高仔豬的成活率與豬只的生產(chǎn)性能和健康水平。endprint

抗菌肽之所以能降低母豬死產(chǎn)率與提高仔豬成活率，與其廣譜的抗菌作用有關(guān)：細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖，是維持細(xì)胞強(qiáng)度和形狀的外被，具有保護(hù)細(xì)胞形態(tài)的作用。當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，細(xì)菌的形態(tài)及對(duì)滲透壓的敏感性都會(huì)產(chǎn)生變化，引起細(xì)胞死亡?？咕目赏ㄟ^(guò)破壞細(xì)胞壁和抑制細(xì)胞壁合成兩方面抑殺細(xì)菌。

Herusimenka等（2005）研究抗菌肽與細(xì)菌的相互作用時(shí)指出，二者之間的相互作用主要通過(guò)肽與多糖之間實(shí)現(xiàn)的?？咕膸д姾?，可取代細(xì)胞壁表面的鎂離子，與細(xì)菌細(xì)胞壁上的負(fù)電荷物質(zhì)通過(guò)靜電引力結(jié)合，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成細(xì)胞壁紊亂區(qū)域，促使抗菌肽穿過(guò)細(xì)胞壁。接近細(xì)胞膜。在革蘭氏陰性菌中，帶負(fù)電荷的物質(zhì)為脂多糖和莢膜多糖，而在革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁表面有帶負(fù)電荷的是磷壁酸。唐亞麗（2009）用抗菌肽MDpep5和MDpep9處理了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，結(jié)果表明，兩種細(xì)菌的A630nm值均有不同程度的下降，說(shuō)明家蠅抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁有一定的溶解作用，可使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增加。喬媛媛等（2010）利用電子顯微鏡觀察了抗菌肽的作用機(jī)理，研究表明?？咕淖饔糜诖竽c桿菌12h后，細(xì)菌的質(zhì)壁發(fā)生分離。使細(xì)胞壁出現(xiàn)空泡。進(jìn)一步證明了抗菌肽可破壞細(xì)胞壁。宮霞等（2011）指出，抗菌肽MDL-2可與細(xì)菌細(xì)胞壁，使其溶解，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌的作用在較低濃度下即可發(fā)生，但對(duì)革蘭氏陰性菌的作用則需達(dá)到一定的濃度才可破壞其細(xì)胞壁。這可能與兩種菌表面的不同組分有關(guān)，在抗菌肽達(dá)到一定濃度時(shí)才能溶解革蘭氏陰性菌表面的脂多糖。

抗菌肽不僅可破壞、溶解細(xì)胞壁，并通過(guò)抑制細(xì)胞壁的合成來(lái)表達(dá)其抗菌活性。蔡永峰和彭德軒（2000）報(bào)道，桿菌肽鋅可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的脫磷酸化過(guò)程，阻礙磷脂載體的運(yùn)轉(zhuǎn)及向細(xì)胞壁支架輸送粘肽，從而抑制細(xì)胞壁的合成。Haster等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，Lipid Ⅱ是細(xì)胞壁的合成前體。而抗菌肽Nisin可移除Lipid Ⅱ在細(xì)胞壁上的合成位點(diǎn)。從而阻礙細(xì)胞壁的合成。Harder（2001）等指出。抗菌肽β-defensin3可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)異常、阻礙細(xì)菌分裂，導(dǎo)致細(xì)胞壁穿孔。引起細(xì)菌死亡。說(shuō)明抗菌肽可通過(guò)阻斷細(xì)胞壁的合成過(guò)程或移除其合成所需的物質(zhì)來(lái)達(dá)到抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成的作用。

2.3提高妊娠母豬與仔豬的免疫力，節(jié)約生產(chǎn)成本

王阿榮（2011）將天蠶素抗菌肽加入母豬日糧中，研究發(fā)現(xiàn)。添加天蠶素抗菌肽對(duì)母豬的繁殖力和仔豬的生長(zhǎng)性能等均無(wú)顯著影響（P>0.05），但是試驗(yàn)Ⅲ組在這兩項(xiàng)指標(biāo)上較對(duì)照組都有提高的趨勢(shì)：各試驗(yàn)組母豬初乳中的水分含量均高于對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05）。各試驗(yàn)組母豬初乳中乳糖含量均高于對(duì)照組，其中只有試驗(yàn)Ⅱ組與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），其它試驗(yàn)組較對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。各試驗(yàn)組母豬初乳中氨基酸水平和脂肪酸含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.05）。從試驗(yàn)整體結(jié)果看。在母豬日糧中添加60g/t天蠶素抗菌肽的試驗(yàn)Ⅲ組效果最佳。說(shuō)明抗菌肽飼料添加劑可有效提高母豬的生產(chǎn)性能。并有效地降低飼養(yǎng)成本，為養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

由于抗菌肽提高了母豬和仔豬的免疫力，在生產(chǎn)中的用藥及人力上有了巨大的節(jié)約，可以進(jìn)一步為養(yǎng)殖戶帶來(lái)可觀的效益。在這里，筆者將為大家普及抗菌肽的幾種抗菌模式。使養(yǎng)殖戶更加明了的認(rèn)知抗菌肽。

2.3.1“桶板”模型（Barrel-stave model）

在該模型中，抗菌肽通過(guò)靜電引力聚集在胞膜表面，形成肽聚體，然后肽聚體的疏水部分垂直插入磷脂雙分子層破壞細(xì)胞膜，形成離子通道，使細(xì)胞滲透壓變化、胞質(zhì)泄露，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。唐亞麗（2009）指出，通過(guò)該模型產(chǎn)生抗菌作用的抗菌肽即可以單體形式，也可以多體形式與胞膜結(jié)合：當(dāng)單體在膜表面的密度較低時(shí)，可互相識(shí)別、聚合，形成多聚體；多肽和胞膜的疏水部分相互結(jié)合。形成離子通道：在離子通道形成過(guò)程中，可通過(guò)在“桶板”上增加單體及小多體，擴(kuò)大通道，加速細(xì)胞死亡。Gkeka和Sark-isov（2009）報(bào)道，抗菌肽跨膜形成的“桶板”通道的主要作用為α-螺旋。每6個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)的肽可形成內(nèi)徑0.52nm左右的螺旋肽，并由此形成“桶板”狀的通道，其中孔道內(nèi)側(cè)為肽的親水部分，外側(cè)為疏水部分。該模型說(shuō)明抗菌肽具有兩親性，并說(shuō)明具有兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽是形成膜孔洞的關(guān)鍵因素。另外，劉忠淵（2008a）指出，除了具有雙親性的α-螺旋，疏水性的α-螺旋或B折疊結(jié)構(gòu)也是使抗菌肽具有穿膜孔洞作用的必需結(jié)構(gòu)。

2.3.2“環(huán)孔”模型（Toroidal Dore model）

“環(huán)孔”模型最初是由Ludtke等在研究滑爪蟾素的作用機(jī)理時(shí)提出的，滑爪蟾素具有兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)。與胞膜作用，可形成透膜孔道（劉立偉和鄧?yán)冢?012）。與“桶板”模型不同的是，抗菌肽與膜結(jié)合時(shí)形成明顯的α-螺旋結(jié)構(gòu)，肽的親水部分與脂質(zhì)的親水部分結(jié)合，共同形成跨膜通道。當(dāng)肽與磷脂的比例達(dá)到一定的值，抗菌肽互相結(jié)合。使膜表面的曲面張力變化，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層內(nèi)外兩層貫通，改變胞膜結(jié)構(gòu)，從而形成環(huán)孔狀通道，最終引起細(xì)胞死亡。Bozelli等（2012）通過(guò)圓二色和熒光光譜對(duì)含13個(gè)殘基的陽(yáng)離子抗菌肽TRP3和含不同脂質(zhì)的胞膜模型之間的作用進(jìn)行了研究，用大單層脂質(zhì)體（LUV）模擬肽一脂質(zhì)聚合體、用膠束模仿“環(huán)孔”模型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，只有當(dāng)雙分子層有負(fù)電荷的磷脂，TRP3才能與其結(jié)合，而無(wú)論膠束表面電荷的正負(fù)。TRP3均可與之結(jié)合，說(shuō)明靜電作用在“環(huán)孔”模型中不占主導(dǎo)作用，并指出。脂質(zhì)雙分子層的曲率可影響肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Sobko等（2004）研究了大腸桿菌素E1（col-icinEl）在磷脂雙分子層和脂質(zhì)體上形成環(huán)孔通道的活性，指出colieinEl形成環(huán)孔通道的活性取決于脂質(zhì)雙分子層的曲率，說(shuō)明脂質(zhì)直接參與了eolieinEl誘導(dǎo)孔壁形成的過(guò)程。并報(bào)道col-icinEl通過(guò)形成環(huán)孔通道。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Yoneyama等（2009）報(bào)道，lacticin Q是一類可在細(xì)胞膜上形成孔隙的細(xì)菌素，并且是目前第一個(gè)可使蛋白泄露的抗菌肽。其形成孔隙的過(guò)程如下：首先，快速與細(xì)胞外膜結(jié)合：其次，形成至少4.6nm的孔隙，引起蛋白質(zhì)泄露：再次，lac-ticin Q從細(xì)胞膜外側(cè)遷移至膜內(nèi)側(cè)。

2.3.3“毯式”模型（Carpet model）

Pouny等（1992）在研究抗菌肽dermaseptin與磷脂膜的相互作用時(shí)提出了抗菌肽的“毯式”模型。當(dāng)濃度較低時(shí)陽(yáng)離子抗菌肽分子以“平鋪”的方式覆蓋在帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，平行于磷脂雙分子層。使其疏水部分與細(xì)胞膜結(jié)合：當(dāng)抗菌肽的濃度達(dá)到一定的閾值，抗菌肽互相結(jié)合形成肽聚體，肽聚體可與細(xì)胞膜結(jié)合，形成類似洗滌劑一脂質(zhì)混合物，使完整的細(xì)胞膜迅速崩潰、細(xì)胞膜被溶解，造成細(xì)胞內(nèi)容物流失、細(xì)胞死亡（Wimley，2010；劉忠淵，2008a）。Lopez-Oyama等（2011）對(duì)抗菌肽Bactenecin與細(xì)胞膜的相互作用進(jìn)行探究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，使抗菌肽通過(guò)“毯式”模型產(chǎn)生抗菌作用的結(jié)構(gòu)主要是β-折疊結(jié)構(gòu)，這可能是由于β-折疊所特有的長(zhǎng)絲狀網(wǎng)格是與細(xì)胞膜產(chǎn)生作用的主要結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ernandez等（2012）分別用DMPC（二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿）和DMPC/DMPG（二肉豆蔻酰磷脂酰甘油）作為真核和原核的模型膜，研究了抗菌肽aurein1.2與胞膜的相互作用，結(jié)果表明，anrein1.2與兩種膜表面均有較強(qiáng)的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層的破壞和膜溶解，并根據(jù)不同類型的磷脂膜的結(jié)構(gòu)變化，說(shuō)明該抗菌肽與膜作用的機(jī)制為“毯式”模型（如圖1所示）。

4展望

抗菌肽作為一種功能性添加劑用于分娩前后的母豬飼糧時(shí)，可以有效提高母豬的免疫機(jī)能和死產(chǎn)率、仔豬初生重和斷奶重，顯著降低哺乳期母豬產(chǎn)生的各種應(yīng)激以及仔豬的腹瀉率和死亡率，進(jìn)而提高整體養(yǎng)殖效益。對(duì)于1000頭母豬場(chǎng)而言，使用抗菌肽飼料添加劑可使年經(jīng)濟(jì)效益至少增加59.25萬(wàn)元。

但有關(guān)于抗菌肽的研究還有以下問(wèn)題有待解決：

（1）抗菌肽是動(dòng)植物免疫系統(tǒng)受到刺激后產(chǎn)生的物質(zhì)。含量極微：雖然可利用化學(xué)方法合成，但成本較高，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)；（2）抗菌肽種類很多，有廣譜的抗菌性：要發(fā)現(xiàn)一種生產(chǎn)成本低，使用效果好的抗菌肽添加劑，還需不斷的研究探索；（3）抗菌肽種類豐富，抗菌機(jī)理各不相同，目前仍沒(méi)有非常明確的、統(tǒng)一的理論；這急需研究者不斷總結(jié)歸納抗菌肽的作用機(jī)制，加快抗菌肽應(yīng)用的推廣。endprint