HPLC法同時測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸含量

申 琳，運(yùn)乃茹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

藥品質(zhì)量與檢驗

HPLC法同時測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸含量

申 琳，運(yùn)乃茹*

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

目的:建立高效液相色譜(HPLC)法同時測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸含量。方法：色譜柱 Thermo BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨(55∶15∶30)；流速0.8 ml/min；檢測波長210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。結(jié)果：熊果酸進(jìn)樣量在31.81～795.2 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量之間線性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均回收率為97.88%；齊墩果酸進(jìn)樣量在33.81～845.2 μg/ml范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量之間線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，平均回收率為98.39%。結(jié)論：本方法可使齊墩果酸、熊果酸得到基線分離，同時測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸的含量。實驗結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度及重復(fù)性好，分離度高，為夏枯草的質(zhì)量控制與評價提供了有效的手段。

夏枯草，熊果酸，齊墩果酸，高效液相色譜法

夏枯草是唇形科夏枯草PrunellavulgarisLinn的干燥果穗[1]，為多年生草本，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因“夏至后即枯”得名，別名棒槌草、鐵色草、大頭花、夏枯頭等。夏枯草辛、苦，寒，入肝、膽經(jīng)，功效清肝、散結(jié)、利尿，用于目赤腫痛、乳癰腫痛、瘰疬癭瘤等[2]。夏枯草主要含有三萜及其苷類、甾醇、香豆素、糖類等多種成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[3,4]，夏枯草具有降壓、降糖、抗菌、特異性免疫抑制等作用。由于其重要的藥用價值及廣泛的藥理作用，日益引起關(guān)注。

熊果酸和齊墩果酸與夏枯草抗炎、免疫抑制作用相關(guān)，《中國藥典》(2005年版)中收錄測定夏枯草中熊果酸含量的HPLC法，但在實際應(yīng)用中，常常因為齊墩果酸具有相似結(jié)構(gòu)而干擾，使色譜分離度達(dá)不到要求，影響熊果酸的實際測定值，使夏枯草質(zhì)量評價結(jié)果存在偏差。本實驗使二者達(dá)到良好的分離效果，也為多指標(biāo)控制夏枯草質(zhì)量提供依據(jù)。除此之外，本研究還優(yōu)化了《中國藥典》中收錄的樣品前處理方法，使其更為快捷簡便[5-11]。

1 儀器和試劑

高效液相色譜儀[Waters Alliance 2695，包括Empower 3工作站、自動進(jìn)樣器、四元梯度泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器(PDA)]；電子天平(塞多利斯BS 210S)；超聲波儀(HENGGAO T&D，HU3120B)。甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號121125)；乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號120924)；乙酸銨(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠，批號20111102)；熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200517)；齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110729-200505)；夏枯草藥材(亳州市中藥飲片廠，批號140901401,150101401,150301401，水分含量10%)；0.5%乙酸銨溶液(稱取乙酸銨0.5 g加水稀釋至100 ml)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Thermo BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨(55∶15∶30)；流速0.8 ml/min；檢測波長210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；采用外標(biāo)法對峰面積進(jìn)行定量。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取熊果酸對照品19.88 mg和齊墩果酸對照品21.13 mg，置于同一25 ml量瓶中，加適量無水乙醇，超聲溶解，放冷，加無水乙醇定容，搖勻，即得對照品溶液。其中熊果酸和齊墩果酸濃度分別為 0.795 2和0.845 2 mg/ml。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取夏枯草粉末(2號篩)2.0 g，置100 ml三角瓶中，加入乙醇40 ml超聲40 min，過濾，濾渣用乙醇洗滌三次，洗滌液合并于濾液中，旋蒸回收溶劑，加入無水乙醇溶解殘渣并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，定容，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1。

1.熊果酸 2.齊墩果酸

2.3 線性關(guān)系考查 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液10、20、30、40、50和60 μl，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分別測定熊果酸和齊墩果酸色譜峰面積。以對照品溶液的濃度對峰面積回歸，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，確定線性范圍。熊果酸回歸方程為Y=2.846 0X-2.751 9(r=0.999 8)，表明熊果酸在31.81～795.2 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；齊墩果酸回歸方程為Y=2.912 3X-1.826 8(r=0.999 9)，濃度在33.81～845.2 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度考查 取同一熊果酸和齊墩果酸混合對照品溶液(濃度分別為0.159 0和0.169 1 mg/ml)，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，熊果酸和齊墩果酸峰面積的RSD值分別為0.34%和0.24%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性考查 取同一供試品溶液(140901401)，按照“2.1”項下色譜條件，分別在0、1、2、4、8、12、16、24和32 h進(jìn)樣，測定峰面積，熊果酸和齊墩果酸峰面積RSD值分別為0.58%和1.59%。結(jié)果表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性考查 取同一樣品(140901401)6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算熊果酸和齊墩果酸的含量，RSD值分別為1.03%和1.39%。結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份夏枯草藥材粉末(140901401)各1 g，準(zhǔn)確加入熊果酸和齊墩果酸對照品各適量，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算含量及加樣回收率。熊果酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為 97.88%和98.39%，RSD分別為1.41%和1.83%。結(jié)果表明，熊果酸和齊墩果酸回收率符合要求，測定方法可行。結(jié)果見表1和表2。

表1 熊果酸加樣回收率試驗結(jié)果

表2 齊墩果酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定 精密稱取3批次夏枯草藥材粉末2.0 g各3份，按照上述方法測定。夏枯草中熊果酸平均含量為0.243%，RSD為1.43%；齊墩果酸平均含量為0.074%，RSD為2.80%。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 含量測定指標(biāo)成分的選擇 夏枯草廣泛的藥理作用日益受到關(guān)注。熊果酸是《中國藥典》(2005版)中夏枯草的法定質(zhì)控成分[12]，而另一成分齊墩果酸由于具有與熊果酸相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性，且在藥材中含量較高，因而在實際應(yīng)用中，兩者的色譜分離度達(dá)不到要求，影響熊果酸的實際測定值，使夏枯草質(zhì)量評價結(jié)果存在偏差。本試驗探求出將齊墩果酸和熊果酸分離度提高的方式，有利于實際工作中二者的含量測定，為進(jìn)一步控制夏枯草質(zhì)量、提高臨床療效提供了基礎(chǔ)工作支持，因而具有實際意義。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇 《中國藥典》(2005版)中收錄的供試品制備方法較為煩瑣耗時，并使用了大量的有毒溶劑。本試驗從提取溶劑、提取方法和提取時間三方面進(jìn)行了優(yōu)化：①提取溶劑：對乙醇、無水乙醇、乙醚和甲醇4種溶劑的提取效率進(jìn)行比較，結(jié)果4種溶劑提取率相近；由于乙醇的毒性低，故選乙醇作提取溶劑，且對熊果酸與齊墩果酸測定無干擾，基線較平穩(wěn)。②提取方法：對比索氏、加熱回流和超聲3種提取方法，提取率相近，考慮到試驗的快捷、簡便，故采用超聲作為提取方法。③提取時間：對樣品溶液超聲提取時間(25、35、40和45 min)進(jìn)行考查，結(jié)果超聲25 min的提取率較低，40和45 min的提取率一樣，因而選擇40 min為提取時間。

3.3 檢測方法的選擇 熊果酸和齊墩果酸系同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)接近，較難分離。采用紫外檢測器檢測時，波長選擇非常重要。檢測波長太低，溶劑系統(tǒng)的截止波長接近檢測波長，造成基線噪音大，平衡基線所需時間長，流動相的本底吸收高，易影響組分檢測；檢測波長太高，二者吸收值太低，響應(yīng)因子小，同樣影響組分檢測。熊果酸和齊墩果酸的無水乙醇溶液在205 nm波長處有最大吸收，但在此波長下，流動相甲醇末端吸收較嚴(yán)重，基線不夠理想，因而選擇210 nm為檢測波長，結(jié)果效果良好。

由于熊果酸和齊墩果酸的結(jié)構(gòu)相近，試驗發(fā)現(xiàn)流動相的組成、比例以及流速的變化對兩種酸的保留時間和峰形影響較大。選用甲醇-水作為流動相時，兩者的保留時間接近，無法使其分開。繼而考查了其他種類和比例的流動相，結(jié)果表明乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨(55∶15∶30)，能使熊果酸與齊墩果酸達(dá)到良好分離。

本研究建立了同時測定夏枯草中熊果酸和齊墩果酸含量的方法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有分離效果好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，為夏枯草的質(zhì)量評價提供了良好的方法和依據(jù)。

1 中國藥典[S].一部.2010:263

2 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].上海: 上?？萍汲霭嫔?1988:1642

3 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？萍汲霭嫔?1977:1827

4 熊斌,雷志勇,陳虹.熊果酸藥理學(xué)的進(jìn)展[M].國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊,2004,6(31):133

5 鐘輝.不同產(chǎn)地白花蛇舌草中熊果酸和齊墩果酸的含量測定[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2010,38(2):105-108

6 張京京,李欽,陳海莉,等.不同產(chǎn)地和品種柿葉中熊果酸和齊墩果酸的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2015,26(1):33-35

7 劉偉,崔永霞,陳志紅,等. HPCE 測定不同產(chǎn)地夏枯草中齊墩果酸、熊果酸、迷迭香酸含量[J].中醫(yī)學(xué)報，2011,26(159):964-966

8 劉茂軍,韓鋒,高靜,等.HPLC 法測定乳癰消痛片中熊果酸[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2013,28(5):727-729

9 劉煒,吳義忠.健胃消食片中熊果酸的含量測定[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(1):5-7

10 李剛,蔡德富,劉吉成.HPLC法測定夏枯草中熊果酸的含量[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院報，2011,32(5):760-761

11 鄭單萍.高效液相色譜法測定夏枯草中熊果酸的含量[J].海峽藥學(xué),2012,24(9):72-74

12 中國藥典[S].一部.2005:197

Simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella Vulgaris Linn by HPLC

Shen Lin，Yun Nairu

(The Second Hospital Attached to Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150)

Objective: To establish a quantitative HPLC method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid inPrunellaVulgarisLinn. Method: The separation was performed on a Thermo BDS Hypersil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-water-0.5% ammonium acetate water solution (55∶15∶30) and the flow rate was 0.8 ml/min. The detection wavelength was at 210 nm. The column temperature was 30 ℃. Results: The linear ranges of ursolic acid and oleanolic acid were 31.81～795.2 μg/ml and 33.81～845.2 μg/ml, respectively. The average recoveries of ursolic acid and oleanolic acid were 97.88% and 98.39%, respectively. Conclusion: The method can be used for quality control ofPrunellaVulgarisLinn, with a good sensitivity, resolution，accuracy and reproducibility.

PrunellaVulgarisLinn,ursolic acid,oleanolic acid,HPLC

2015-10-15

R927.2

A

1006-5687(2016)02-0001-03

*通訊作者：運(yùn)乃茹，E-mail：59368539@qq.com。