植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究

戴住波 王 勇 周志華 李盛英 張學(xué)禮*

1 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津 300308

2 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 上海 200032

3 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 青島 266101

植物能合成微量次生代謝物，進(jìn)而發(fā)揮機(jī)體生物防御和信號傳導(dǎo)作用。由于這些植物天然產(chǎn)物對人體有較強(qiáng)的生理活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥健康等領(lǐng)域。據(jù)中國社會科學(xué)院醫(yī)藥藍(lán)皮書《中國藥品市場報(bào)告（2012）》稱，中國藥品市場 2012 年總規(guī)模為 9 261 億元人民幣；預(yù)計(jì)到 2020 年，中國藥品市場的規(guī)模將達(dá)到 2.3 萬億元人民幣[1]。植物天然產(chǎn)物一直作為藥物、保健品及化妝品的重要來源，如嗎啡、青蒿素、麻黃素和紫杉醇等藥效顯著的藥物均屬于植物源藥物；年銷售額超過 400 億美元的激素類藥物，目前主要是以薯蕷皂素、番麻皂素和劍麻皂素等植物皂素為基礎(chǔ)原料生產(chǎn)[2,3]。另外，植物天然產(chǎn)物在農(nóng)藥、獸藥及其他與人類生活密切相關(guān)的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中也具有廣泛的需求和應(yīng)用，如黃連中的黃連素等生物堿類抗生素在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用有良好安全性，已經(jīng)成為理想的飼用抗生素替代品。與此同時(shí)，高品質(zhì)的植物天然產(chǎn)物，如人參皂苷、玫瑰精油、番茄紅素、花青素、新型甜味劑羅漢果苷和甜菊糖等，是人類化妝品、保健品和調(diào)味劑的主要原料，市場前景廣闊[3]。

植物提取是目前植物天然產(chǎn)物的主要生產(chǎn)方式。這種傳統(tǒng)生產(chǎn)模式有較多缺點(diǎn)，如天然產(chǎn)物含量低且差異大，植物生長周期長，類似物復(fù)雜導(dǎo)致產(chǎn)品純化難，以及對生物資源尤其是野生植物資源造成嚴(yán)重破壞等[3-5]。隨著市場需求的日益增大，野生名貴中藥靈芝、人參、三七的原植物均已瀕?；蛞巴鉁缃^，目前的資源供給已經(jīng)難以為繼[3]。在化學(xué)合成方面，由于大部分天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有較多的手性中心，合成過程中容易形成無活性甚至有毒的、難以分離的旋光異構(gòu)體；而且合成過程步驟繁瑣，轉(zhuǎn)化率低，能耗高，所用有機(jī)溶劑易造成污染，難以滿足工業(yè)化需求[3]。而植物組織細(xì)胞培養(yǎng)法操作較復(fù)雜、周期長，且由于生產(chǎn)成本過高，所以也不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。相比較而言，利用釀酒酵母釀造啤酒的類似原理，通過發(fā)酵生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物具有生產(chǎn)周期短、不受時(shí)節(jié)和原料供應(yīng)的限制、發(fā)酵產(chǎn)物比較單一、易于分離純化等優(yōu)點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

基于合成生物學(xué)的原理，設(shè)計(jì)和創(chuàng)建人工合成細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物，既能有效控制原料供給，又能保護(hù)自然資源及環(huán)境，其作為一種綠色高效的新型生產(chǎn)模式已被科學(xué)界及工業(yè)界認(rèn)可[3]。近年來，隨著合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，微生物合成植物源天然產(chǎn)物的種類不斷增多，產(chǎn)量也在逐年攀升[6-8]。本文將從研究路線出發(fā)，在萜類、苯丙素類和生物堿等化合物的生產(chǎn)應(yīng)用案例中介紹人工合成細(xì)胞生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀。

1 植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究路線

在實(shí)現(xiàn)植物天然產(chǎn)物發(fā)酵法生產(chǎn)的過程中，特征基因元件挖掘與優(yōu)化、生物合成途徑優(yōu)化和細(xì)胞工廠性能提升等組成了植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的基本內(nèi)容。

1.1 特征元件挖掘與優(yōu)化

除啟動(dòng)子、終止子等主要控制基因表達(dá)的基因元件外，鑒定和優(yōu)化植物天然產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵基因元件是應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)革新天然產(chǎn)物生產(chǎn)方式的核心和源頭。

植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析，目前主要采取基因組或轉(zhuǎn)錄組-異源重建的方法進(jìn)行挖掘。近年來，基于基因測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，嗎啡[9-12]、甘草酸[13]、人參皂苷[5]、丹參酮[7,14]、葫蘆素[15]、羅漢果苷[16]、依托泊苷[17]和長春花堿[18]等重要植物天然產(chǎn)物生物合成途徑的解析取得突破。一批重要類型的基因功能元件被挖掘和鑒定，其中被稱為“萬能生物催化劑”的細(xì)胞色素 P450 酶的催化機(jī)制被深入研究[19-21]。然而，自然界中存在的有重要價(jià)值的植物天然產(chǎn)物（如青蒿素和嗎啡等）就有上萬種。由于各種制約因素，在這樣一個(gè)相當(dāng)豐富的群體中，只有極少數(shù)分子的生物合成過程機(jī)制得到解析。因此，開發(fā)高效、可靠和低成本的方法平臺，進(jìn)行規(guī)?；闹参锾烊划a(chǎn)物合成途徑的分子基礎(chǔ)與過程機(jī)制解析，對植物天然產(chǎn)物這一自然寶庫的系統(tǒng)保護(hù)和有效開發(fā)具有重要戰(zhàn)略意義。

在功能元件優(yōu)化方面，對于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理較清晰的酶，可采用理性設(shè)計(jì)的方法。如基于纖維假絲酵母木糖還原酶（XR）的結(jié)構(gòu)，對 Lys274 和 Asn276 等氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了突變后，發(fā)現(xiàn) XR 對輔因子 NADPH 的偏好性提高了 170 倍[3,22]。然而，來源于植物天然產(chǎn)物合成途徑的功能酶類型復(fù)雜，絕大多數(shù)的晶體結(jié)構(gòu)未得到解析。對這類酶的改造，目前一般是用隨機(jī)突變等方法對正突變進(jìn)行進(jìn)一步富集，從而使酶的活性、熱穩(wěn)定性、對底物的親和力和偏好性得到很大改善[3]。如利用隨機(jī)突變的方法，對類球紅細(xì)菌合成酶進(jìn)行定向進(jìn)化改造，使番茄紅素工程菌株產(chǎn)量提高了近一倍[23]。

另外，通過功能酶融合和搭建蛋白質(zhì)腳手架的方法，可使代謝途徑中各個(gè)酶形成可控的復(fù)合體，提高底物的有效濃度，降低毒性中間體的積累，從而達(dá)到提高底物轉(zhuǎn)化率的效果[3]。如融合釀酒酵母內(nèi)源的法尼基焦磷酸合成酶及牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合成酶，可顯著提高釀酒酵母牻牛兒牻牛兒基焦磷酸的合成能力[7]；通過搭建蛋白質(zhì)手腳架的方法，優(yōu)化甲羥戊酸的 3 個(gè)合成酶的比例和空間布局來提高產(chǎn)物生成量，同時(shí)降低細(xì)胞負(fù)荷，最終甲羥戊酸的濃度提高了 77 倍[24]。

1.2 生物合成途徑優(yōu)化

利用基因元件在宿主細(xì)胞中進(jìn)行異源生物合成途徑的重建，一般需要考慮多種影響途徑合成效率的因素，例如：物質(zhì)和能量的平衡，異源代謝產(chǎn)物對宿主細(xì)胞生理性能的影響（毒性），異源代謝產(chǎn)物、功能酶、生物途徑及宿主細(xì)胞之間的兼容性等多個(gè)方面。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)出一些優(yōu)化生物合成途徑的策略。

（1）物質(zhì)流分配控制。通過調(diào)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)來控制目標(biāo)化合物在物質(zhì)流供給網(wǎng)絡(luò)中的分配比例。如在青蒿酸工程菌構(gòu)建過程中，通過提高生物合成途徑上游基因的表達(dá)來增加前體供給和抑制分支途徑基因的表達(dá)來減少底物競爭物質(zhì)流控制方案，顯著提高了工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)青蒿酸的能力[3,25]。

（2）合成途徑的精確控制。通過建立啟動(dòng)子文庫來精確控制基因的表達(dá)量，使合成途徑中各基因協(xié)調(diào)表達(dá)，減少中間代謝產(chǎn)物積累，降低細(xì)胞負(fù)荷，最終提高工程菌株的發(fā)酵生產(chǎn)性能[3]。如利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子對脂肪酸合成途徑和異源的樺木酸合成途徑進(jìn)行協(xié)同表達(dá)，發(fā)現(xiàn)工程菌株樺木酸的產(chǎn)量可在 200 倍范圍內(nèi)變化[26]。

（3）合成途徑的動(dòng)態(tài)控制。微生物合成途徑優(yōu)化中極為重要的一環(huán)是對途徑中各代謝物進(jìn)行動(dòng)態(tài)定量和監(jiān)測。依靠對目標(biāo)代謝物的特異敏感性，生物傳感器（biosensor）可將代謝物的變化信息通過多種信號實(shí)時(shí)輸出，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測和反饋?；诖颂匦裕飩鞲衅骺梢詰?yīng)用于構(gòu)建動(dòng)態(tài)代謝物調(diào)節(jié)回路，增加目標(biāo)化合物的產(chǎn)量[3]。如，利用可以響應(yīng)丙酰輔酶 A 的生物傳感器監(jiān)測胞內(nèi)丙酰輔酶 A 的積累，從而反饋下調(diào)乙酰輔酶 A 羧化酶的表達(dá)來降低細(xì)胞毒性[27]；利用 RNA 微矩陣方法鑒定出的法尼基焦磷酸生物傳感器可用于平衡代謝流，增加紫槐二烯的產(chǎn)量[28]。

1.3 細(xì)胞工廠性能提升

細(xì)胞工廠綜合效率的提高受很多因素影響，包括高效的原料利用率、產(chǎn)物的儲存能力、優(yōu)秀的發(fā)酵性能等多個(gè)方面。近期科學(xué)家們在亞細(xì)胞區(qū)室利用、產(chǎn)物儲存、酶載體和菌株抗污染等方面發(fā)展了新的策略。

（1）細(xì)胞器空間的充分利用。細(xì)胞中的線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器能為生物反應(yīng)提供催化環(huán)境。例如，利用導(dǎo)肽將法尼基焦磷酸合酶和瓦倫烯合酶定位到酵母細(xì)胞器線粒體中，可以增加工程菌天然香精瓦倫烯的合成[29]；通過將嗎啡生物合成途徑中相關(guān)酶的 C 端錨定至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以增加嗎啡的生成率[30]。

（2）細(xì)胞膜工程。植物天然產(chǎn)物中有相當(dāng)部分是疏水化合物，它們一般會滯留在細(xì)胞中，但由于細(xì)胞空間有限，從而影響目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的科學(xué)家近期研究了大腸桿菌細(xì)胞膜改造對提高萜類化合物合成能力的影響。研究結(jié)果顯示，調(diào)控與細(xì)胞膜合成相關(guān)基因，能使細(xì)胞的膜量增加并向內(nèi)堆積，從而顯著提高用于存儲 β- 胡蘿卜素的空間，增加了工程菌中 β- 胡蘿卜素產(chǎn)量[31]。

（3）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工程。為功能酶提供更多的催化場地是近期發(fā)展的一種新方法，如通過敲除釀酒酵母的 PHA1 基因來提高酵母中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的含量，極大地增大了定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞色素 P450 酶的附著空間，提高了酶的含量和催化產(chǎn)物的產(chǎn)量[32]。

（4）非典型營養(yǎng)物質(zhì)利用。在工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中，雜菌的污染較常見，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效率。Novogy 公司和美國麻省理工學(xué)院的科學(xué)家首先改造釀酒酵母、解脂耶氏酵母和大腸桿菌等微生物營養(yǎng)元素的利用途徑，通過在發(fā)酵過程中使用雜菌不能利用的營養(yǎng)元素建立發(fā)酵工藝，能顯著提高工程微生物細(xì)胞的抗污染能力[33]。

2 研究案例

近 10 年來，植物天然產(chǎn)物的合成生物學(xué)領(lǐng)域研究發(fā)展迅速。萜類、苯丙素類和生物堿等系列植物天然產(chǎn)物的人工合成細(xì)胞工廠被成功創(chuàng)建。

抗瘧一線藥物青蒿素，是由 20 世紀(jì) 70 年代中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所屠呦呦及其研究團(tuán)隊(duì)在我國傳統(tǒng)中草藥青蒿中發(fā)現(xiàn)的一種倍半萜類化合物[3]。過去的生產(chǎn)方式為，從黃花蒿中直接提取。美國加州大學(xué)伯克利分校的科學(xué)家歷時(shí) 10 年，實(shí)現(xiàn)了利用酵母細(xì)胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)青蒿酸，并開發(fā)了經(jīng)簡單化學(xué)反應(yīng)合成青蒿素的工藝[6]。經(jīng)計(jì)算，其在不到 100 m3發(fā)酵車間中年產(chǎn)青蒿素能達(dá)到 35 t，相當(dāng)于我國近 5 萬畝耕地的種植產(chǎn)量。該項(xiàng)工作被認(rèn)為是利用人工合成細(xì)胞生產(chǎn)植物萜類天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的里程碑工作[3]。

在鎮(zhèn)痛藥物的生產(chǎn)方面，美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家結(jié)合功能元件挖掘和優(yōu)化、合成途徑構(gòu)建及優(yōu)化等手段，將一系列細(xì)菌、植物、動(dòng)物以及酵母來源的功能基因?qū)虢湍钢?，?shí)現(xiàn)了發(fā)酵法生產(chǎn)嗎啡等阿片類生物堿的突破[34]。

在抗癌藥物的生產(chǎn)方面，美國麻省理工學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌中引入了二萜抗癌藥物紫杉醇生物合成的紫杉二烯合成酶，并對上游 MEP 功能模塊及下游萜類合成功能模塊進(jìn)行精確調(diào)控，最終獲得了產(chǎn)量達(dá) 1 g/L 的紫杉二烯的細(xì)胞工廠[35]。

在俗稱“腦黃金”的 DHA 和 EPA 等長鏈脂肪酸生產(chǎn)方面，杜邦公司的研發(fā)人員在脂肪酸含量可占 40% 細(xì)胞干重的解脂耶氏酵母中引入 21 個(gè)編碼 5 種不同酶的外源基因，工程菌株可生產(chǎn)占 15% 細(xì)胞干重的長鏈脂肪酸 EPA[36]。

我國在植物天然產(chǎn)物人工合成細(xì)胞的研究領(lǐng)域有很好的工作基礎(chǔ)。建立了一整套植物天然產(chǎn)物合成生物學(xué)生產(chǎn)的技術(shù)體系，包括植物天然產(chǎn)物基因元件挖掘技術(shù)、高通量自動(dòng)化克隆技術(shù)、合成途徑創(chuàng)建與精確調(diào)控技術(shù)、發(fā)酵與分離提取技術(shù)。也創(chuàng)建了包括 β- 欖香烯、類胡蘿卜素、人參皂苷、天麻素、甜菊糖苷、三萜酸、紅景天苷、羅漢果甜苷、燈盞乙素等一系列植物天然產(chǎn)物的人工合成細(xì)胞，詳述如下。

2.1 萜類

萜類化合物廣泛存在于自然界中，目前已超過 5 萬種的萜類化合物被發(fā)現(xiàn)，其中大部分是藥用植物中的有效成分[37]。青蒿素、抗癌藥物紫杉醇、具有保健作用的人參皂苷及作為抗氧化劑的類胡蘿卜素類化合物均屬于萜類[3]。

2.1.1 萜類香精

全球香精香料市場廣闊，檀香醇、廣藿香醇、橙花叔醇、β- 欖香烯等萜類精油廣泛應(yīng)用于日化品、食品和藥品等領(lǐng)域。其中，β- 欖香烯是從姜科植物溫郁金、莪術(shù)等藥用植物中提取的國家一類抗癌藥物的有效成分。天然來源的 β- 欖香烯含量低、化學(xué)類似物組成復(fù)雜等原因，導(dǎo)致其分離成本過高。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所與中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心合作，利用代謝工程與合成生物學(xué)技術(shù)提高釀酒酵母中萜類的生物合成通量和產(chǎn)物兼容性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行吉瑪烯 A 合成酶的蛋白質(zhì)工程改造和高產(chǎn)吉瑪烯 A 工程菌創(chuàng)建，并成功開發(fā)吉瑪烯 A 熱轉(zhuǎn)化為 β- 欖香烯的耦合工藝，最終將高純度 β- 欖香烯獲得成本降為植物提取的 0.15%[38]。

2.1.2 丹參酮

近幾年來，我國在丹參酮人工合成細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。丹參酮屬于松香烷型二萜化合物，是我國傳統(tǒng)中藥丹參的主要有效成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種活性。中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心與中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所、美國愛荷華州立大學(xué)、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心、中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所等研究單位合作，發(fā)現(xiàn)了催化生成丹參酮基本骨架——次丹參酮二烯的兩個(gè)功能酶[39]，構(gòu)建了高產(chǎn)次丹參酮二烯的酵母工程菌株[7,40]。進(jìn)而利用 C-13 同位素標(biāo)記技術(shù)，確定了該碳骨架結(jié)構(gòu)在丹參酮生物合成中的作用。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)現(xiàn)了催化次丹參酮二烯生成代謝中間產(chǎn)物鐵銹醇的關(guān)鍵酶基因 CYP76AH1，并構(gòu)建了高產(chǎn)鐵銹醇的酵母工程菌[14]。之后又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了催化 C-7、C-11 和 C-20 位點(diǎn)的 P450 基因，獲得了能同時(shí)產(chǎn)生多種丹參酮類化合物的酵母工程菌[41]。

2.1.3 甜菊糖

甜菊糖是下一代重要的健康天然甜味劑。中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所通過構(gòu)建甜葉菊功能基因數(shù)據(jù)庫，對甜菊糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶進(jìn)行了充分挖掘。成功鑒定了甜菊糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，并在大腸桿菌底盤細(xì)胞中重構(gòu)了從頭合成甜菊糖苷類化合物的非天然合成途徑。經(jīng)一系列理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，使大腸桿菌中甜菊糖生物合成的關(guān)鍵中間體產(chǎn)量得到大幅度提高，并成功地獲得了其主要組分RA[42]。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又解析了甜葉懸鉤子與明日葉中甜茶素的生物合成過程，報(bào)道了 6 條新的二萜糖基轉(zhuǎn)移酶，并對其底物識別的機(jī)制進(jìn)行了研究。通過不同物種來源的糖基轉(zhuǎn)移酶的正交組合，在微生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了甜茶素的高效全細(xì)胞轉(zhuǎn)化[43]。該研究為實(shí)現(xiàn)重要二萜類糖苷化合物的合成生物制造奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為改造大腸桿菌成為復(fù)雜萜類化合物異源合成的底盤細(xì)胞提供了成功范例。

2.1.4 人參皂苷

人參皂苷是名貴中藥人參和西洋參的有效成分，是原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸三類苷元在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下形成的系列混合物的總稱，具有抗腫瘤[44,45]、降血糖[46]、促免疫等功能。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所與中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心合作，在釀酒酵母中首次成功構(gòu)建原人參二醇的生物合成途徑，并且發(fā)現(xiàn)鯊烯環(huán)氧酶在控制三萜化合物的生物合成中起關(guān)鍵作用[3]。在此基礎(chǔ)上，通過提高關(guān)鍵基因的表達(dá)活性，將原人參二醇的產(chǎn)量提高了 262 倍。再通過雙相發(fā)酵工藝優(yōu)化，最終將原人參二醇的產(chǎn)量提高至 1 g/L[47]。近期，合作團(tuán)隊(duì)公開報(bào)道了將細(xì)胞工廠三萜合成通量提高到 10 g/L 級別的構(gòu)建方案，創(chuàng)建出產(chǎn)量能達(dá)到 15 g/L 人參皂苷前體的高效酵母細(xì)胞工廠[48]。另外，將齊墩果酸、原人參二醇和原人參三醇這 3 個(gè)功能模塊導(dǎo)入同一底盤細(xì)胞，獲得能同時(shí)合成 3 種人參基本皂苷元的第一代基于多組分概念的“人參酵母”細(xì)胞工廠[49]。

中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所與中國科學(xué)院上海藥物研究所合作，首先從人參中克隆和鑒定了合成稀有人參皂苷 CK、Rh2、Rg3、Rh1 和 F1 所需要關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶和 P450 還原酶 PgCPR1。在此基礎(chǔ)上通過細(xì)胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了利用單糖發(fā)酵生產(chǎn)稀有人參皂苷 CK、Rh2、Rg3、Rh1 和 F1 的工藝，目前產(chǎn)量均超過 2 g/L[5,50,51]。近期該團(tuán)隊(duì)又從人參和三七中進(jìn)一步挖掘了 20 多個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，較全面解析了人參和三七皂苷的生物合成途徑。相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的專利已經(jīng)進(jìn)入 6 個(gè)國家和地區(qū)進(jìn)行審查，其中在中國和日本已經(jīng)獲得授權(quán)（PCT/CN2013/088819）。

2.1.5 三萜酸類

蘋果、山楂、枇杷、棗和梨等水果表皮蠟質(zhì)中含有微量的高值三萜酸類活性成分，包括科羅索酸、山楂酸、麥珠子酸和積雪草酸等化合物。它們在抗病毒[52]、糖尿病控制[53]和皮膚修復(fù)[54]等方面有廣泛用途，是一類重要的膳食補(bǔ)充劑。其中，科羅索酸在抗糖尿病方面有顯著作用[53]，被認(rèn)為是一種天然植物胰島素。從原植物中直接提取是目前生產(chǎn)這類化合物的主要方式。為了創(chuàng)建高效微生物細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)這類藥效化合物的發(fā)酵法生產(chǎn)，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了“即插即用”生物合成途徑快速解析平臺，包括植物組織培養(yǎng)、差異轉(zhuǎn)錄組測序分析和代謝物分析、候選基因在底盤細(xì)胞中的表征及化合物鑒定。利用這一平臺，團(tuán)隊(duì)從藥用植物山楂 P450 庫中首次篩選到能催化齊墩果酸和烏索酸生成 2 位 α- 羥化產(chǎn)物山楂酸和科羅索酸的功能 P450 酶 MAA45。在此基礎(chǔ)上，創(chuàng)建出高效生產(chǎn)山楂酸和科羅索酸的釀酒酵母細(xì)胞工廠，產(chǎn)量分別達(dá) 384 mg/L 和 141 mg/L[55,56]。

2.1.6 類胡蘿卜素

類胡蘿卜素在醫(yī)藥、營養(yǎng)品、化妝品以及食品領(lǐng)域具有重要用途。β- 胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素是代表性的類胡蘿卜素。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所以類胡蘿卜素為研究對象，從物質(zhì)代謝調(diào)控、能量代謝調(diào)控和細(xì)胞生理調(diào)控這 3 個(gè)方面開展研究，較為系統(tǒng)地解析了微生物高效合成萜類化合物的調(diào)控機(jī)制[57,58]。① 在物質(zhì)代謝方面，發(fā)現(xiàn) IspG 和 IspH 是重要的限速步驟，并且這兩個(gè)酶需要協(xié)同表達(dá)才能發(fā)揮作用。IspG 的單獨(dú)過表達(dá)會導(dǎo)致有毒中間代謝物 HMBPP 積累，嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長代謝[58]。② 在能量代謝方面，通過對中央代謝途徑（磷酸戊糖和 TCA）的多尺度模塊化調(diào)控，發(fā)現(xiàn) TCA 途徑的代謝通量是大腸桿菌好氧合成 NADPH 的最主要限制因素，解決了萜類化合物合成代謝中的還原力不平衡問題[57]。③ 在細(xì)胞生理調(diào)控方面，系統(tǒng)研究了大腸桿菌細(xì)胞膜存儲能力的限制因素，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜形態(tài)和細(xì)胞膜組分合成能力是制約大腸桿菌細(xì)胞膜存儲能力的關(guān)鍵因素。引入外源的膜折疊蛋白，能改變大腸桿菌的細(xì)胞膜形態(tài)，形成細(xì)胞膜向內(nèi)的褶皺。增強(qiáng)甘油磷脂合成能力可以進(jìn)一步增加細(xì)胞膜向內(nèi)的褶皺，從而進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞膜存儲能力并顯著提高萜類化合物的產(chǎn)量[31]。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建出一系列高效生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物細(xì)胞工廠。在 200 L 發(fā)酵罐中完成了番茄紅素的中試驗(yàn)證，發(fā)酵 48 小時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá) 7 g/L。

2.2 苯丙素等莽草酸途徑來源產(chǎn)物

苯丙素是天然存在的一類苯環(huán)與 3 個(gè)直鏈碳連接構(gòu)成的化合物，如花青素、白藜蘆醇和咖啡酸等。它們主要在抗氧化作用、心血管保健、抗病毒和凝血等方面有顯著藥理活性。這些化合物的發(fā)酵法生產(chǎn)最近也有新的突破，其中 Evolva 公司研發(fā)的白藜蘆醇生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。我國科學(xué)家在天麻素、燈盞乙素、紅景天苷和丹參素等方面有突破性進(jìn)展。

2.2.1 天麻素

天麻是我國名貴中藥材之一，天麻素作為天麻的主要活性成分，臨床上廣泛應(yīng)用于神經(jīng)衰弱及神經(jīng)衰弱綜合征的治療。然而天麻資源本身珍稀，且其天麻素含量低（僅為 0.4%），因而天麻素的植物提取價(jià)格昂貴。另外，化學(xué)合成方法存在成本較高和污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)；植物中天麻素的生物合成通路至今還未解析清楚。因而，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所團(tuán)隊(duì)以大腸桿菌莽草酸通路的分支酸為前體，通過過表達(dá)來源于大腸桿菌、諾卡氏菌和枯草芽孢桿菌的關(guān)鍵基因，并引入植物紅景天來源的糖基轉(zhuǎn)移酶 UGT73B6，在國際上首次創(chuàng)建了天麻素大腸桿菌合成通路。通過進(jìn)一步調(diào)控莽草酸通路、UDP- 葡萄糖通路、NADPH 還原力，對糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行突變和篩選，發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高了天麻素產(chǎn)量。目前，以葡萄糖為原料的天麻素生產(chǎn)成本預(yù)計(jì)在 500 元/kg 以下，僅為植物提取的 1/200，化學(xué)合成的 1/2[59]。近期，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所和湖南師范大學(xué)合作，利用芳烴前體 4- 甲酚的氧化降解途徑進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天麻素的研究。目前，在搖瓶中投入 5 mmol/L 4- 甲酚前體時(shí)，天麻素產(chǎn)量能達(dá)到 433.3 mg/L[20,21,60]。

2.2.2 燈盞乙素

燈盞花藥品是治療心腦血管疾病的必備藥品，在中國心腦血管領(lǐng)域中燈盞花制劑產(chǎn)品已經(jīng)占據(jù)了約 7% 的市場份額。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所與云南農(nóng)業(yè)大學(xué)合作，利用合成生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，成功從燈盞花基因組中鑒定到燈盞乙素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，并在釀酒酵母底盤中成功構(gòu)建了燈盞乙素合成的細(xì)胞工廠。通過代謝工程改造與發(fā)酵工藝優(yōu)化，目前細(xì)胞工廠生產(chǎn)的燈盞乙素含量已達(dá)到百毫克級[61]。

2.2.3 丹參素

丹參素是來源于丹參的多酚類藥物，天津大學(xué)利用丹參素與細(xì)胞自身代謝產(chǎn)物對羥苯基丙酮酸的相似性，創(chuàng)建了全新的人工替代生物合成途徑；并理性改造人工元件乳酸脫氫酶和羥化酶，提升與非天然底物的特異性，實(shí)現(xiàn)了微生物細(xì)胞工廠高效合成丹參素，發(fā)酵產(chǎn)量達(dá) 7 g/L[62]。

2.2.4 紅景天苷

紅景天苷是一種極具開發(fā)前景的環(huán)境適應(yīng)藥物。紅景天生長于高寒環(huán)境，資源匱乏，不易種植，藥用組分含量低，且含有有毒物質(zhì)雜質(zhì)。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所團(tuán)隊(duì)利用莽草酸通路在大腸桿菌中構(gòu)建了紅景天苷的合成通路，通過酶的定向進(jìn)化和代謝調(diào)控等工作，獲得一個(gè)高產(chǎn)紅景天苷的工程菌。經(jīng)過進(jìn)一步的發(fā)酵條件優(yōu)化，目前大腸桿菌生產(chǎn)紅景天的成本僅是植物提取成本的 1/40[59]。

3 展望

近年來，基于合成生物學(xué)原理設(shè)計(jì)人工合成細(xì)胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物的研究，已經(jīng)取得了一系列堅(jiān)定領(lǐng)域發(fā)展信心的成績，如青蒿素、β- 欖香烯、番茄紅素、人參皂苷及嗎啡等細(xì)胞工廠的成功創(chuàng)建[3]。相比傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，這種新的資源獲取策略在資源可持續(xù)利用和經(jīng)濟(jì)效益等方面均具有很顯著的優(yōu)勢，因而作為一種革新模式嶄露頭角。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅我國就有上萬種含有生物活性成分的藥用植物（中藥），它們?yōu)楝F(xiàn)代藥物開發(fā)提供了靶點(diǎn)豐富的前體藥物寶庫，同時(shí)其豐富的生物合成途徑為我們提供了催化類型多樣的天然酶庫。然而“雙寶庫”的有效開發(fā)是高度交叉的前沿研究領(lǐng)域，需要集生物學(xué)、信息學(xué)、化學(xué)、中藥學(xué)、藥學(xué)等多種學(xué)科的共同努力和協(xié)作攻關(guān)。

具體到理論和技術(shù)方面的現(xiàn)狀，目前生物合成途徑的規(guī)?；馕龊驮旖ㄔO(shè)、生物途徑高通量組裝和優(yōu)化、人造系統(tǒng)的調(diào)試等方面還處于初級發(fā)展階段，人工智能等自動(dòng)化技術(shù)參與程度較低。一些化合物類型的研究基礎(chǔ)薄弱，工程細(xì)胞異源合成效率還比較低，導(dǎo)致發(fā)酵法成本與傳統(tǒng)路線相比經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢不明顯，需要進(jìn)一步加強(qiáng)攻關(guān)。但總的來說，隨著人工智能技術(shù)的逐漸成熟，植物基因組的測序技術(shù)低成本化，高通量化學(xué)合成基因技術(shù)的完善，以及全局代謝網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的代謝途徑優(yōu)化理念和操作的進(jìn)一步突破等，最終人們將真正迎來植物源天然產(chǎn)物人工合成的新時(shí)代。