合成生物學(xué)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展

崔金明 王力為 常志廣 臧中盛 劉陳立*

1 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055

2 中國(guó)科學(xué)院 前沿科學(xué)與教育局 北京 100864

當(dāng)前，國(guó)際合成生物學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出學(xué)科和產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展、齊頭并進(jìn)的新局面。合成生物學(xué)這一學(xué)科的首要特征便是系統(tǒng)化地采用工程手段，有目的地設(shè)計(jì)人工生命體系，其研究范圍涵蓋較廣。其中，合成生物學(xué)技術(shù)的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究受到了科技界和醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，合成生物學(xué)以人工設(shè)計(jì)的基因線路改造人體自身細(xì)胞，或改造細(xì)菌、病毒等人工生命體，再使其間接作用于人體。這些經(jīng)人工設(shè)計(jì)的生命體能夠感知疾病特異信號(hào)或人工信號(hào)、特異性靶向異常細(xì)胞和病灶區(qū)域、表達(dá)報(bào)告分子或釋放治療藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)人體生理狀態(tài)的監(jiān)測(cè)以及對(duì)典型疾病的診斷與治療。人工生命體因其智能性、復(fù)雜性和安全可控性等優(yōu)點(diǎn)，將提升人們對(duì)腫瘤、代謝疾病、耐藥菌感染等頑疾的診斷、治療和預(yù)防水平，從而發(fā)揮合成生物學(xué)技術(shù)的顛覆性優(yōu)勢(shì)，有望開(kāi)創(chuàng)智能生物診療的新時(shí)代。近期的一些研究進(jìn)展綜述如下。

1 細(xì)菌、病毒等人工生命體的設(shè)計(jì)改造

1.1 人工細(xì)菌的診療應(yīng)用

細(xì)菌作為人類體內(nèi)與體表最常見(jiàn)、數(shù)量最多的外源生物，從人類出生到死亡，細(xì)菌時(shí)時(shí)刻刻都與人的新陳代謝、免疫和衰老產(chǎn)生著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。以大腸桿菌等模式微生物為代表，細(xì)菌因其較易培養(yǎng)、結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、研究較為透徹和易于基因編輯等特點(diǎn)成為合成生物學(xué)研究與開(kāi)發(fā)中較理想的底盤(pán)。近年來(lái)，合成生物學(xué)家通過(guò)精巧設(shè)計(jì)并構(gòu)建智能基因線路，已在人體常在菌及一些致病菌中實(shí)現(xiàn)了計(jì)算、感知、記憶、響應(yīng)等功能，并將其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究與疾病診療，以期滿足醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的特殊需求。

1.1.1 人工細(xì)菌用于腫瘤診療

基于合成生物學(xué)技術(shù)的細(xì)菌工程化改造為腫瘤治療提供了全新的思路，細(xì)菌療法因其具有良好的靶向性、較低的毒副作用，日益得到重視。早在 200 多年前，醫(yī)生們就注意到了細(xì)菌感染有時(shí)會(huì)減緩腫瘤生長(zhǎng)甚至將其根除。William Coley 醫(yī)生將細(xì)菌滅活，制成了“科利毒素”（Coley’s toxins），最終成功治療了超過(guò) 1 000 名腫瘤患者，這種治療方法的成功率居然與現(xiàn)代的癌癥治療方法不相上下[1]。包括破傷風(fēng)梭菌、丁酸梭菌等致病菌，以及嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌等非致病菌都被報(bào)道可以用來(lái)治療癌癥，沙門(mén)氏菌由于其兼性厭氧、靶向能力強(qiáng)、具有天然毒性、易于改造等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最理想的腫瘤治療載體[2,3]。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院團(tuán)隊(duì)著重于采用合成生物學(xué)手段，降低細(xì)菌毒性、提高靶向能力和賦予細(xì)菌多樣化的功能，以期將細(xì)菌改造成更特異、更智能、更高效的抗腫瘤“武器”。細(xì)菌療法在腫瘤微環(huán)境中不僅具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠重新喚醒宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制；還可以將細(xì)菌作為藥物或細(xì)胞因子的遞送載體，增強(qiáng)腫瘤抑制效果。目前，該團(tuán)隊(duì)改造的人工細(xì)菌已進(jìn)入臨床前研究階段并取得理想療效，有望成為全球首個(gè)用于治療實(shí)體瘤的活體生物藥物。

美國(guó)麻省理工學(xué)院與加州大學(xué)圣地亞哥分校團(tuán)隊(duì)向大腸桿菌中植入 lacZ 報(bào)告基因，這一基因能夠在細(xì)菌接觸到腫瘤細(xì)胞時(shí)開(kāi)啟表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的 LacZ 酶。接著，研究人員向小鼠注射交聯(lián)的化學(xué)發(fā)光底物，這一底物在 LacZ 酶存在的情況下會(huì)被切割從而釋放化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并匯集到小鼠尿液中。具有這一信號(hào)的尿液樣品會(huì)由原本的黃色變?yōu)榧t色。研究人員可以僅通過(guò)監(jiān)測(cè)尿液顏色變化，從而對(duì)小鼠是否患瘤及腫瘤狀態(tài)進(jìn)行初步推測(cè)。研究人員發(fā)現(xiàn)這一手段比常規(guī)顯微鏡檢測(cè)更加靈敏，能夠檢出直徑小于 1 cm 的腫瘤[4]。

加州大學(xué)圣地亞哥分校與麻省理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了細(xì)菌周期性同步的藥物合成和裂解釋放系統(tǒng)。團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了基于群體感應(yīng)的基因線路，讓細(xì)菌在腫瘤環(huán)境內(nèi)生長(zhǎng)達(dá)到一定濃度閾值后自毀，同步爆發(fā)性釋放出抗癌藥物。該方法能夠在實(shí)現(xiàn)細(xì)菌載藥遞送的前提下，最大程度上維持體內(nèi)較低的細(xì)菌定殖數(shù)量，并減少對(duì)周圍組織的損傷及毒副作用[5]。

1.1.2 人工細(xì)菌用于代謝疾病診療

美國(guó)生物藥物公司 Synlogic 在2017年8月正式登陸納斯達(dá)克資本市場(chǎng)，其重點(diǎn)業(yè)務(wù)是利用合成生物學(xué)遺傳改造益生菌來(lái)治療代謝疾病、炎癥和癌癥等。Synlogic 對(duì)益生菌進(jìn)行基因改造后開(kāi)發(fā)的 SYNC1618 被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)定為治療苯丙酮尿癥（PKU）的孤兒藥。Synlogic 還發(fā)起了尿素循環(huán)障礙（UCD）合成生物學(xué)治療藥品的人體臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證人工細(xì)菌的治療潛力。

哥倫比亞大學(xué)研發(fā)了腸道活細(xì)菌“記錄儀”，可以實(shí)現(xiàn)腸道內(nèi)多種代謝物的檢測(cè)。該團(tuán)隊(duì)改造了一段 DNA 質(zhì)粒，使其在腸道微生物宿主中響應(yīng)外部信號(hào)時(shí)可以創(chuàng)建更多的自身拷貝，同時(shí)使用另一個(gè)獨(dú)立的表達(dá) CRISPR-Cas 系統(tǒng)組件的質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)記錄儀和標(biāo)記時(shí)間。在沒(méi)有外部信號(hào)的情況下，只有記錄質(zhì)粒活動(dòng)，細(xì)胞把這些間隔序列拷貝插入基因組 CRISPR 位點(diǎn)。當(dāng)添加外部信號(hào)時(shí)，另一質(zhì)粒也被激活，其序列也被插入至 CRISPR 位點(diǎn)。這樣，混合而成的背景序列就富含了時(shí)間和信號(hào)信息。研究人員可以通過(guò)檢查細(xì)菌的各個(gè) CRISPR 位點(diǎn)，用計(jì)算機(jī)工具讀取細(xì)菌都經(jīng)歷了什么。文章證明，該系統(tǒng)至少能處理 3 個(gè)同步信號(hào)并儲(chǔ)存宿主腸道中 3 天的數(shù)據(jù)信息[6]。

麻省理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)研發(fā)了由活細(xì)胞傳感器和超低功率微型電子器件組成的可吞入診斷工具。通過(guò)表達(dá)特定基因線路的有益大腸桿菌，細(xì)菌在遇到血紅素后立即表達(dá)發(fā)光蛋白，以檢驗(yàn)消化道出血。細(xì)菌位于被半透膜覆蓋的定制傳感器上，這種膜可以允許周圍小分子透過(guò)，但不會(huì)泄露細(xì)菌。在盛放細(xì)菌的 4 個(gè)小皿下面是一個(gè)光電晶體管，用于測(cè)量細(xì)菌的產(chǎn)光量，并將數(shù)據(jù)傳遞給微處理器，再通過(guò)無(wú)線電發(fā)送給附近的計(jì)算機(jī)或智能手機(jī)。研究人員專門(mén)開(kāi)發(fā)了一款 Android 應(yīng)用程序用來(lái)分析這些數(shù)據(jù)。當(dāng)傳感器通過(guò)胃部時(shí)，內(nèi)部細(xì)菌就能一路捕獲目標(biāo)標(biāo)志物。傳感器總長(zhǎng)僅約 3.8 cm，運(yùn)行功率約 13 μW；目前在大型哺乳動(dòng)物豬身上已證明了傳感器的有效性[7]。該團(tuán)隊(duì)還另外設(shè)計(jì)了響應(yīng)炎癥標(biāo)志物的其他傳感器。

1.1.3 人工細(xì)菌用于抵抗瘧原蟲(chóng)

瘧疾由瘧原蟲(chóng)這種單細(xì)胞生物寄生誘發(fā)，瘧原蟲(chóng)通過(guò)受感染的雌性按蚊叮咬傳至人類。因此，對(duì)按蚊的控制被認(rèn)為是預(yù)防瘧疾的重要手段。中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所等發(fā)現(xiàn)一種沙雷氏菌屬（Serratia）的新菌株 AS1 能在按蚊中進(jìn)行持續(xù)跨代傳播，并成功地人工構(gòu)建出能同時(shí)分泌表達(dá) 5 個(gè)抗瘧基因的菌株，能夠有效減少 92%—93% 的瘧原蟲(chóng)卵囊。通過(guò)高效驅(qū)動(dòng)抗瘧效應(yīng)分子快速散播到整個(gè)蚊群中，能夠使按蚊成為無(wú)效的瘧疾媒介，實(shí)現(xiàn)從源頭上阻斷瘧疾傳播[8]。

1.2 人工病毒/噬菌體的診療應(yīng)用

病毒是最簡(jiǎn)單的生命體，對(duì)病毒的基因改造非常有助于我們對(duì)特定基因的認(rèn)識(shí)和利用。新興的合成生物學(xué)為研究病毒及開(kāi)發(fā)診療策略提供了新的思路和手段。

1.2.1 人工病毒用于減毒疫苗構(gòu)建

北京大學(xué)團(tuán)隊(duì)通過(guò)合成生物學(xué)方法構(gòu)建減毒活疫苗的策略被稱為“合成減毒病毒工程技術(shù)”。研究人員利用琥珀密碼子（終止密碼子）可以識(shí)別非天然氨基酸的原理，將病毒復(fù)制基因的部分編碼密碼子突變成終止密碼子，使其在感染人體細(xì)胞后，不能進(jìn)行完整的蛋白質(zhì)翻譯，從而獲得了活病毒疫苗。所獲得的病毒疫苗具有安全性和有效性。進(jìn)一步突變 3 個(gè)以上三聯(lián)密碼子，使病毒由預(yù)防性疫苗變?yōu)橹委煵《靖腥镜乃幬?，且其藥效隨著三聯(lián)密碼子數(shù)目的增加而增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)顛覆了病毒疫苗研發(fā)的理念，成為活病毒疫苗的重大突破。與依賴于少數(shù)的幾個(gè)氨基酸突變所獲得的傳統(tǒng)減毒活病毒相比較，合成減毒病毒的減毒效果來(lái)源于多達(dá)幾百處的密碼子變化所產(chǎn)生的累積效應(yīng)，因此幾乎不可能回復(fù)突變到野生型病毒，其安全性大大提高；同時(shí)，獲得減毒病毒株所需時(shí)間短，極大地縮短了疫苗的研發(fā)周期[9]。中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所團(tuán)隊(duì)成功利用該技術(shù)研制出新型的寨卡病毒（ZIKV）弱毒疫苗，單次免疫后就可以刺激小鼠產(chǎn)生高滴度中和抗體，獲得完全的攻毒保護(hù)，并且可以阻止 ZIKV 通過(guò)母體垂直傳播給子代。由于其基因組中引入了 2 568 個(gè)同義突變，回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)極低[10]。

1.2.2 人工病毒用于腫瘤治療

人工改造的溶瘤病毒可以通過(guò)選擇性腫瘤細(xì)胞殺傷和抗腫瘤免疫的雙重殺瘤機(jī)制，選擇性地復(fù)制和殺死癌細(xì)胞而不傷害健康組織。其原理在于，腫瘤驅(qū)動(dòng)突變往往特異性地增加腫瘤細(xì)胞中病毒復(fù)制的選擇性，且許多腫瘤細(xì)胞具有抗病毒 I 型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)的缺陷，因此支持選擇性病毒復(fù)制。腫瘤微環(huán)境中的病毒復(fù)制，可以克服腫瘤的免疫抑制，并促進(jìn)抗腫瘤免疫。例如，北京奧源和力生物技術(shù)有限公司研發(fā)的重組人 GM-CSF 單純皰疹病毒注射液（OrienX010），其基因組中刪除了 HSV-1的致病基因，并插入了編碼人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的 DNA 片段，使產(chǎn)品只特異性在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡，同時(shí)釋放腫瘤抗原，并通過(guò)載體表達(dá)的 GM-CSF 蛋白激活全身抗腫瘤抗原的特異性免疫反應(yīng)。OrienX010 已進(jìn)入了國(guó)家優(yōu)先審評(píng)藥品目錄，最快有望于 2019 年批準(zhǔn)上市，用于瘤內(nèi)注射治療惡性黑色素瘤。目前已上市的溶瘤病毒產(chǎn)品有上海三維生物技術(shù)公司的安科瑞（腺病毒）用于頭頸瘤治療、美國(guó)安進(jìn)公司的 T-VEC（單純皰疹病毒）用于黑色素瘤治療等。目前，我國(guó)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的還有中山大學(xué)團(tuán)隊(duì)的甲病毒 M1，可用于 13 種高發(fā)腫瘤的療效及安全性評(píng)估；北京市神經(jīng)外科研究所的溶瘤病毒 ON-01，可用于復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤的治療評(píng)估等[11]。

1.2.3 人工噬菌體用于耐藥菌治療

Sample6 Technologies 公司利用合成生物學(xué)技術(shù)改造噬菌體，可使噬菌體直接識(shí)別并殺死細(xì)菌，或產(chǎn)生特定酶來(lái)破壞細(xì)菌保護(hù)膜，從而使細(xì)菌被抗生素或機(jī)體免疫系統(tǒng)殺滅。

上海噬菌體與耐藥研究所 2018 年 8 月成功治愈了一例超級(jí)細(xì)菌感染患者?；颊呤且晃话螂啄[瘤術(shù)后復(fù)雜性、反復(fù)性尿路感染者，2014 年因全尿路內(nèi)滋生了多重耐藥的肺炎克雷伯菌（以下簡(jiǎn)稱“肺克”），肺克在左、右腎盂和膀胱中分別建立了感染，3 處的肺克有聯(lián)系又有差異，治療難度很大。治療團(tuán)隊(duì)最終確定了治療方案：腎盂造瘺后通過(guò)造瘺管進(jìn)行噬菌體沖洗合并抗生素靜滴治療 1 周，而后?？股夭⒗^續(xù)噬菌體治療 1 周，最后全部停藥并連續(xù)觀察 1 個(gè)月。最終，患者泌尿系統(tǒng)的肺克被徹底殺滅，尿路刺激癥狀顯著改善，生活質(zhì)量得到了明顯提高[12]。

2 人類自身細(xì)胞的設(shè)計(jì)改造

人體由體細(xì)胞與生殖細(xì)胞共同組成。體細(xì)胞作為人體結(jié)構(gòu)和功能的基本單元，其數(shù)量達(dá) 40 萬(wàn)億—60 萬(wàn)億個(gè)，決定著人體的健康狀況。生殖細(xì)胞則影響著下一代的健康狀況。在體外細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中，經(jīng)基因線路改造的人工細(xì)胞在單基因遺傳病、癌癥診斷、癌細(xì)胞識(shí)別、代謝性疾?。ㄈ缤达L(fēng)、糖尿病和高血壓等）、感染性疾病治療和干預(yù)等方面已取得重大突破，為進(jìn)一步開(kāi)展臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.1 人工細(xì)胞用于遺傳病的基因治療

醫(yī)學(xué)史上有一些改變疾病治療范式的大事件，比如外科手術(shù)的發(fā)明、抗生素的發(fā)現(xiàn)，而下一個(gè)大事件很可能是正在成熟的基因治療。2017 年，美國(guó) FDA 首次批準(zhǔn)一種針對(duì)眼科遺傳病的療法 Luxturna。不久的將來(lái)，更多的基因治療方法將從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，掀起一場(chǎng)新的醫(yī)學(xué)革命，以往無(wú)法治愈的遺傳疾病將從根源上得到緩解。

從原理上來(lái)說(shuō)，基于小分子藥物或蛋白的療法需要反復(fù)給藥（例如糖尿病患者需要反復(fù)注射胰島素），而如果可修復(fù)病人的錯(cuò)誤基因，那么單次治療就可產(chǎn)生持續(xù)的治療效果，達(dá)到控制甚至逆轉(zhuǎn)遺傳疾病的療效?；蛑委熡袃纱笙葲Q條件：① 需要有遞送新基因的載體，最有臨床前景的是逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒載體；② 需要有編輯、修復(fù)錯(cuò)誤基因的手段，介導(dǎo)基因添加、基因刪除、基因校正，以及細(xì)胞內(nèi)其他高度靶向的基因組修飾，一般是采用三大基因編輯技術(shù)——鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶技術(shù)（TALEN）和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)技術(shù)（CRISPR）。

基因治療可以指針對(duì)體細(xì)胞所攜帶的單基因遺傳病，在體內(nèi)原位進(jìn)行的基因療法，也可以在體外改造血紅細(xì)胞并回輸人體內(nèi)的療法（亦稱細(xì)胞療法）。由于涉及人工細(xì)胞的設(shè)計(jì)改造以實(shí)現(xiàn)特定治療功能，因此屬于合成生物學(xué)范疇?；蛑委熢谂R床治療中非常有潛力，是合成生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的重大成果，許多不治之癥有望得到緩解，近期案例包括：

2017 年，Sangamo 公司開(kāi)展了全球首例人體內(nèi)基因編輯治療[13]。44 歲的 Brian Madeux 患有先天新陳代謝異常疾病亨特氏綜合征，被通過(guò)靜脈注射將數(shù)十億份矯正基因及精準(zhǔn)基因編輯工具注入患者體內(nèi)。研究人員表示治療效果很好，沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用或安全問(wèn)題。2018 年2月，Sangamo 公司被批準(zhǔn)實(shí)施第二位患者的體內(nèi)基因治療。

輝瑞公司在臨床實(shí)驗(yàn)中用鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZFP-TFs）來(lái)治療 C9ORF72 基因突變引起的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS），也稱為漸凍人癥，以及另一種叫額顳葉大葉性變性（FTLD）的神經(jīng)變性疾病[14]。

賽諾菲集團(tuán)旗下子公司 Bioverativ 從患者體內(nèi)收集造血干細(xì)胞（HSCs），然后利用 ZFN 技術(shù)在體外對(duì)調(diào)控 BCL11A 基因的紅細(xì)胞增強(qiáng)子進(jìn)行精確切割，促使 BCL11A 基因的表達(dá)下降。接受過(guò)基因編輯的 HSCs 會(huì)被重新注回患者體內(nèi)，它們可以繼續(xù)增殖并且分化為成熟的血紅細(xì)胞，從而緩解鐮狀細(xì)胞病患者的癥狀。這種自體細(xì)胞療法的優(yōu)勢(shì)在于不依靠病毒載體對(duì)基因進(jìn)行編輯，從而避免病毒載體可能帶來(lái)的副作用[14]。

英國(guó)制藥公司 Shire 開(kāi)發(fā)出了亨廷頓氏病基因療法。亨廷頓氏病是由單個(gè)基因 htt 基因中的特定類型突變引起的。該療法通過(guò)鋅指蛋白特異性下調(diào) htt 突變體基因，從而選擇性地抑制突變型亨廷頓蛋白（HTT）的表達(dá)，同時(shí)保持正常基因拷貝的表達(dá)水平不變，以期逆轉(zhuǎn)亨廷頓氏病的癥狀，阻止病情惡化。該療法目前正在臨床前研究階段[14]。

除了治療目的，還有生物黑客正利用基因治療技術(shù)改造自身細(xì)胞，期望獲得增強(qiáng)的人體功能。例如，原 NASA 科學(xué)家 Josiah Zayner 采用 CRISPR 技術(shù)，在自己身體內(nèi)引入 Myostatin 基因突變，以增強(qiáng)肌肉生長(zhǎng)。還有生物黑客在自己視網(wǎng)膜引入視紫紅質(zhì)基因，試圖增強(qiáng)視力[15]。

2.2 人工細(xì)胞用于腫瘤診療

人工設(shè)計(jì)改造的免疫 T 細(xì)胞正在成為強(qiáng)有力的癌癥藥物，腫瘤細(xì)胞免疫治療被認(rèn)為是 2017 年全球生物科技最大“風(fēng)口”，癌癥免疫療法還拿下了 2018 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。繼以 PD-1/PD-L1 為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑藥物在癌癥研究和治療領(lǐng)域大放異彩，CAR-T 療法更成為有望戰(zhàn)勝癌癥的重磅武器。CAR-T 技術(shù)，即采用人工合成的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CARs）在體外工程化改造T細(xì)胞。與天然的生理抗原受體不同，CARs 可以被工程化設(shè)計(jì)，識(shí)別腫瘤特異的蛋白質(zhì)、糖脂、HLA 多肽復(fù)合物等。人工設(shè)計(jì)改造后的 T 細(xì)胞經(jīng)過(guò)擴(kuò)增再回輸患者體內(nèi)，特異性識(shí)別、結(jié)合、殺傷癌癥細(xì)胞，從而達(dá)到靶向治療的目的。

在臨床應(yīng)用領(lǐng)域，CAR-T 療法當(dāng)前在全球正在進(jìn)行 307 項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中 164 項(xiàng)來(lái)自中國(guó)。2018 年 7 月，美國(guó)批準(zhǔn)了諾華公司的 Kymriah（曾用名 CTL019）這一全球首個(gè) CAR-T 產(chǎn)品上市，用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病，Kymriah 產(chǎn)品定價(jià)為 47.5 萬(wàn)美元。Kite 公司的Yescarta（KTE-C19）也緊隨其后獲批上市，產(chǎn)品定價(jià) 37.3 萬(wàn)美元。

我國(guó)研發(fā)單位在激烈的全球競(jìng)爭(zhēng)中不落下風(fēng)，臨床試驗(yàn)數(shù)量約占全球一半，靶點(diǎn)除 CD19 之外還包括 MCU-1、EPCAM 和 GPC3 等最新靶點(diǎn)。中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院（301 醫(yī)院）已于 2014 年開(kāi)始了相關(guān)臨床試驗(yàn)，其研發(fā)管線也最為豐富；四川大學(xué)華西醫(yī)院、第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院、上海腫瘤研究所與仁濟(jì)醫(yī)院等也取得了良好療效。國(guó)內(nèi)進(jìn)入 CAR-T 領(lǐng)域的公司有藥明巨諾、復(fù)星凱特、上海昆朗、上海比昂、科濟(jì)生物、優(yōu)卡迪、恒潤(rùn)達(dá)生、中源協(xié)和、南京傳奇、南京凱地、北京馬力喏、西比曼和博雅控股等。

CAR-T 技術(shù)在新靶點(diǎn)尋找、實(shí)體瘤攻克、通用型生產(chǎn)等方面，仍需不斷改善。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，科學(xué)家也在利用合成生物學(xué)手段，不斷設(shè)計(jì)性能更優(yōu)的人工細(xì)胞。近期研究進(jìn)展包括：

深圳市第二人民醫(yī)院團(tuán)隊(duì)利用邏輯“與門(mén)”及“信號(hào)連接器”概念，設(shè)計(jì)構(gòu)建基因線路進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞識(shí)別和治療。該團(tuán)隊(duì)利用 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)成功構(gòu)建了攜帶邏輯“與門(mén)”的基因線路，利用膀胱癌特異性啟動(dòng)子 UPⅡ和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶作為輸入信號(hào)：當(dāng)兩種啟動(dòng)子均激活時(shí)，方可啟動(dòng)下游信號(hào)（如熒光素酶）的表達(dá)，從而將膀胱癌細(xì)胞與其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分；當(dāng)輸出信號(hào)為細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，則還可實(shí)現(xiàn)特異性殺傷目的。該研究為膀胱癌和其他腫瘤檢測(cè)和治療提供了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的合成生物學(xué)平臺(tái)，對(duì)開(kāi)發(fā)新的腫瘤生物治療器件具有重要的指導(dǎo)意義。該團(tuán)隊(duì)還創(chuàng)造性地提出“信號(hào)連接器”概念，即將發(fā)揮內(nèi)源蛋白識(shí)別功能的核酸適配體 RNA 與發(fā)揮靶點(diǎn) mRNA 識(shí)別功能的引導(dǎo) gRNA 連接，這種新型“信號(hào)連接器”可在細(xì)胞內(nèi)特異性識(shí)別癌信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子，并進(jìn)一步借助 gRNA 靶向抑制癌信號(hào)分子的翻譯效率，從而在診斷上定量檢測(cè)多個(gè)層面的生物信號(hào)，綜合判斷膀胱癌細(xì)胞所處的疾病狀態(tài)，并在治療上利用重新構(gòu)建的基因線路替代膀胱癌細(xì)胞內(nèi)原已受損的基因線路使細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)，從而達(dá)到了精準(zhǔn)診斷、特異高效治療腫瘤的目的[16]。

加利福尼亞大學(xué)團(tuán)隊(duì)合成了細(xì)胞感應(yīng)分子——Notch（包含新的外部傳感部件和新基因活化部件）用于殺死腫瘤細(xì)胞。研究表明，Notch 分子可以讓細(xì)胞在體內(nèi)識(shí)別多種分子并打開(kāi)特定基因的響應(yīng)。例如，細(xì)胞會(huì)感應(yīng)分子損傷并打開(kāi)刺激修復(fù)的基因，或感應(yīng)癌癥相關(guān)分子并激活相應(yīng)功能基因，促使免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞。它們還可用于感應(yīng)微小人造支架的蛋白質(zhì)，令細(xì)胞分化填充膀胱、肝臟或生成替代器官[17]。

基于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的基因表達(dá)譜的顯著差異，麻省理工學(xué)院團(tuán)隊(duì)研發(fā)了自動(dòng)檢測(cè)癌癥信號(hào)的合成基因線路，專門(mén)區(qū)分癌細(xì)胞和非癌細(xì)胞，觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊癌細(xì)胞。利用病毒載體將基因線路呈遞給目標(biāo)細(xì)胞后，合成啟動(dòng)子就會(huì)與腫瘤細(xì)胞的特定活躍蛋白結(jié)合，完成自身活化；當(dāng)兩種癌癥啟動(dòng)子同時(shí)被激活后，基因線路才會(huì)自動(dòng)打開(kāi)；隨后，各種功能蛋白（細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子等）就會(huì)引導(dǎo) T 細(xì)胞識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞[18]。

2.3 人工細(xì)胞用于代謝疾病診療

人工設(shè)計(jì)的細(xì)胞能夠感知代謝疾病的特異信號(hào)或人工信號(hào)，特異性表達(dá)報(bào)告分子或釋放治療藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)人體生理代謝狀態(tài)的監(jiān)測(cè)，以及對(duì)典型疾病的診斷與治療。

瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用人類的腎臟細(xì)胞（HEK-293 細(xì)胞），設(shè)計(jì)獲得了具有正常 β 細(xì)胞功能的人工 HEK-β 細(xì)胞。這種細(xì)胞可以直接感受血液中的葡萄糖濃度，當(dāng)血糖濃度超過(guò)一定閾值后，HEK-β 細(xì)胞便可以分泌足夠的胰島素用來(lái)降血糖。該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了光控合成生物學(xué)線路，有效控制了糖尿病小鼠體內(nèi)的血糖濃度。此外，結(jié)合納米技術(shù)、生物技術(shù)與信息技術(shù)，可用射頻信號(hào)、手機(jī)程序等手段遠(yuǎn)程激活應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng)，也可控制胰島素的釋放。這些研究為動(dòng)態(tài)調(diào)控人工細(xì)胞應(yīng)用于人類糖尿病治療提供了有力支持[19]。

華東師范大學(xué)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一株含有胰島素傳感器的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 HEKIR-Adipo，并通過(guò)微囊包裹技術(shù)將其移植到胰島素抵抗性糖尿病、肥胖癥、飲食誘導(dǎo)性肥胖癥等多種高胰島素血癥小鼠模型中。人工細(xì)胞能高效識(shí)別、自我回饋調(diào)節(jié)血液中胰島素水平，當(dāng)血液里的胰島素超過(guò)一定閾值后，其可以調(diào)控表達(dá)脂聯(lián)素（Fcadiponectin），從而緩解胰島素抵抗癥狀，起到治療效果。研究人員還設(shè)計(jì)合成了遠(yuǎn)紅光調(diào)控基因表達(dá)的定制化細(xì)胞，該定制化細(xì)胞在遠(yuǎn)紅光的照射下，可以被激活表達(dá)任何想要的報(bào)告基因或藥物蛋白基因，如產(chǎn)生綠色熒光蛋白或胰島素等。當(dāng)研究人員將遠(yuǎn)紅光控制胰島素表達(dá)的定制化細(xì)胞移植到糖尿病小鼠皮下時(shí)，給予糖尿病小鼠直接遠(yuǎn)紅光照射，可以激活皮下移植的細(xì)胞表達(dá)胰島素并起到良好的降血糖效果[20]。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了糖尿病診療一體化智能控制系統(tǒng)：小鼠的血糖值由血糖儀讀取獲得后，可通過(guò)藍(lán)牙無(wú)線發(fā)送到定制的智能控制器和智能手機(jī)中。當(dāng)血糖值高于預(yù)先設(shè)定的安全血糖閾值時(shí)，智能控制器可以點(diǎn)亮移植在小鼠體內(nèi)含有定制化細(xì)胞的水凝膠 LED 復(fù)合體，從而激活定制化細(xì)胞產(chǎn)生胰島素或 GLP-1 達(dá)到降血糖并維持血糖穩(wěn)定的作用，最終實(shí)現(xiàn)自動(dòng)診斷、精準(zhǔn)治療的目的[21]。在另一項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)將齊墩果酸（OA）的藥理學(xué)活性和胰高血糖素樣肽（shGLP-1）的改善胰島素抵抗、改善肝功能、改善胰腺功能完美集合起來(lái)。構(gòu)建優(yōu)化的基因線路，經(jīng) OA 誘導(dǎo)可以精準(zhǔn)調(diào)控 shGLP-1 的表達(dá)，使得肝源性糖尿病模型小鼠的糖耐受、胰島素抵抗、高血糖癥、脂代謝紊亂，以及肝功能紊亂等多種代謝異常癥狀同時(shí)得到有效改善[22]。

2.4 人類生殖細(xì)胞的設(shè)計(jì)改造

設(shè)計(jì)修改人類生殖細(xì)胞或胚胎的基因，能夠在嬰兒出生之前就清除致命疾病，因而未來(lái)前景廣闊。但由于涉及對(duì)人類胚胎的操縱，且修改后的基因可以遺傳，因此該方面的研究存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)及倫理法律爭(zhēng)議。

2015 年，中山大學(xué)研究人員使用 CRISPR 基因編輯技術(shù)，修正人類胚胎中導(dǎo)致 β 型地中海貧血的基因。研究選用的是來(lái)自志愿者的廢棄且不能正常發(fā)育的胚胎[23]。2016 年 4 月，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院團(tuán)隊(duì)成功使用 CRISPR 編輯技術(shù)對(duì)人類胚胎進(jìn)行基因編輯，精確定位切除了 CCR5 基因的 32 個(gè)堿基，使得部分胚胎獲得了對(duì)艾滋病病毒的免疫能力[24]。2017 年 8 月，美國(guó)俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)等團(tuán)隊(duì)合作使用基因編輯工具 CRISPR 系統(tǒng)，完成了對(duì)人類胚胎中導(dǎo)致肥厚型心肌病的 MYBPC3 基因突變的安全修復(fù)[25]。該技術(shù)還能夠編輯修復(fù)其他高外顯率的疾病基因，如引起囊腫性纖維化或乳腺癌的相關(guān)基因。胚胎基因編輯技術(shù)與體外生殖及移植前基因診斷技術(shù)相結(jié)合，將能夠徹底預(yù)防遺傳疾病傳播給子孫后代。

2.5 用于人工細(xì)胞設(shè)計(jì)合成的使能技術(shù)的發(fā)展與動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

人體細(xì)胞作為高等真核細(xì)胞的一種，具有多樣性、多細(xì)胞性、復(fù)雜調(diào)控、細(xì)胞分化、亞細(xì)胞區(qū)室化等特殊性質(zhì)，為合成生物學(xué)提供了無(wú)限可能。DNA 的高效遞送及靶向穩(wěn)定整合、基因編輯、人工染色體設(shè)計(jì)合成、豐富多樣的基因調(diào)節(jié)、區(qū)室隔離的代謝反應(yīng)等使能技術(shù)的成熟發(fā)展，將極大促進(jìn)人工設(shè)計(jì)的人體細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。由于篇幅所限，在此不作詳細(xì)介紹。

動(dòng)物模型研究對(duì)于臨床研究必不可少，可為其提供技術(shù)范本和理論依據(jù)?？茖W(xué)家將基因編輯技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建獲得了一批動(dòng)物模型，自 1996 年第一只體細(xì)胞克隆綿羊“多莉”誕生后，小鼠、牛、山羊、豬、貓、兔、騾、馬、大鼠等多種哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞克隆相繼獲得成功，但犬與猴的克隆難度較大。近年來(lái)中國(guó)科學(xué)家在這些方面取得突破，中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所團(tuán)隊(duì)成功培育出世界上首對(duì)體細(xì)胞克隆猴，靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的建立對(duì)于腦疾病領(lǐng)域的研究意義非凡[26]。中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院團(tuán)隊(duì)以 ApoE 基因敲除犬的耳部皮膚成纖維細(xì)胞作為核移植供體，構(gòu)建了世界首個(gè)基因敲除體細(xì)胞克隆的動(dòng)脈粥樣硬化狗模型[27]；該團(tuán)隊(duì)還把人突變的亨廷頓基因粘貼到豬的亨廷頓基因中，獲得的小豬模型不僅具有大腦中特異神經(jīng)元選擇性死亡這個(gè)特征，而且能表現(xiàn)出類似舞蹈樣的異常行為，這些病理特征及異常行為都可以穩(wěn)定地遺傳給后代，從而為臨床研究提供了可靠的動(dòng)物模型[28]。

3 合成生物診療的未來(lái)展望

人工改造的活細(xì)菌、活細(xì)胞、病毒/噬菌體可能是迄今為止人類開(kāi)發(fā)的最復(fù)雜的“藥物”，有望解決一些至今讓醫(yī)學(xué)界束手無(wú)策的疾病。從近年趨勢(shì)來(lái)看，合成生物診療未來(lái)將迎來(lái)更多的臨床試驗(yàn)和商業(yè)開(kāi)發(fā)。

在大規(guī)模開(kāi)展臨床試驗(yàn)的同時(shí)，合成生物學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，我們也不能忘記把目光重新聚焦于基礎(chǔ)研究。例如，盡管 CAR-T 腫瘤免疫治療當(dāng)前非常熱門(mén)，但在頂級(jí)期刊 Nature Medicine（《自然醫(yī)學(xué)》）上剛剛發(fā)表了一個(gè)令人震驚的 CAR-T 細(xì)胞治療后復(fù)發(fā)的臨床案例[29]，這一技術(shù)意外搞出了“CAR-癌細(xì)胞”：其原因是本該加到 T 細(xì)胞上、幫助 T 細(xì)胞特異性識(shí)別 CD19 并抓住癌細(xì)胞的 CAR（嵌合抗原受體），意外地被加到患者癌變的 B 細(xì)胞上，形成了“CAR-癌細(xì)胞”；加到癌細(xì)胞上的 CAR 會(huì)與癌細(xì)胞表面的 CD19 結(jié)合，讓 CAR-T 細(xì)胞失去了識(shí)別癌細(xì)胞的靶標(biāo)，這名患者最終由于“CAR-癌細(xì)胞”大量增殖導(dǎo)致死亡。

因此，對(duì)人工活體藥物的理性設(shè)計(jì)、精確定量控制、體內(nèi)體外功能的預(yù)測(cè)、從基因到表型的機(jī)制，以及活體藥物進(jìn)入人體內(nèi)的命運(yùn)等，還需要更加深入的研究?；铙w藥物設(shè)計(jì)改造應(yīng)充分考慮宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)、基因線路控制、系統(tǒng)魯棒性等因素，以期達(dá)到更好的時(shí)間和空間上的可控性，使治療更具針對(duì)性。未來(lái)，合成生物學(xué)基礎(chǔ)研究的深度很大程度上將決定臨床應(yīng)用的成敗。

合成生物診療技術(shù)在進(jìn)步的同時(shí)，也需要政策與倫理研究的跟進(jìn)，以保證這種革命性的技術(shù)健康有序發(fā)展。相對(duì)于其他治療方式，合成生物學(xué)診療涉及一些新的倫理與安全問(wèn)題。2016 年，美國(guó) FDA 出臺(tái)了一份指南[30]，明確闡明了一些以食物或膳食補(bǔ)充劑合法問(wèn)世的活性生物療法產(chǎn)品（live biotherapeutic product，LBP）能怎樣被用于研究，并解釋了研究人員在早期臨床試驗(yàn)中，要滿足怎樣的生產(chǎn)要求，才能將益生菌當(dāng)作藥物。

我國(guó)在這方面的監(jiān)管仍需加快布局，確保在現(xiàn)有的監(jiān)管體系內(nèi)建立起現(xiàn)代、高效的評(píng)估政策。一方面充分發(fā)揮活性生物療法產(chǎn)品的潛在益處，另一方面也了解其中的特定風(fēng)險(xiǎn)。合成生物診療產(chǎn)品還需要更多的研發(fā)，需要精心設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)來(lái)確保這些產(chǎn)品的安全性與有效性，從而釋放合成生物學(xué)在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力，造福個(gè)體與公眾健康。