符合工程化需求的生物元件設(shè)計(jì)

崔穎璐 吳 邊

中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101

2000 年，以撥動(dòng)開關(guān)（toggle switch）與合成振蕩器（synthetic oscillator）為標(biāo)志的基因設(shè)計(jì)研究使合成生物學(xué)走進(jìn)了人們視野[1,2]。近年來，隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，人們很快認(rèn)識(shí)到，生物系統(tǒng)可以在定量模型指導(dǎo)下，用“模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化”的組成單元來設(shè)計(jì)構(gòu)建人工復(fù)雜系統(tǒng)。其中，生物元件作為合成生物學(xué)三大基本要素之一，對(duì)其進(jìn)行深入挖掘和改造已成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。為了方便利用模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化的“部件”拼裝“機(jī)器”，2003 年，美國麻省理工學(xué)院相關(guān)合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室成立了標(biāo)準(zhǔn)生物元件登記庫（Registry of Standard Biological Parts，http://partsregistry.org），收集滿足標(biāo)準(zhǔn)化條件的生物元件。截至 2018 年已有超過 20 000 個(gè)生物元件被登記，其中包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄單元、質(zhì)粒骨架、蛋白質(zhì)編碼區(qū)等 DNA 序列，以及核糖體綁定位點(diǎn)、終止子等 RNA 序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

天然生物元件來源于自然進(jìn)化，在模塊化、組裝、集成等方面，難以符合特定工程需求。如果將細(xì)胞看成合成工廠，由 DNA 編碼的蛋白質(zhì)和 RNA 等轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控、催化基本元件在生命體系中體現(xiàn)出一定的交互性和模塊性。如何讓不同單元之間、單元與途徑和網(wǎng)絡(luò)之間可控、可組裝，是工程化設(shè)計(jì)創(chuàng)建生物系統(tǒng)首要面臨的問題。目前，大量已知功能的生物元件并未被標(biāo)準(zhǔn)化，許多元件體現(xiàn)出不兼容性，加之整合過程中的復(fù)雜性和整合后的可變性等因素，導(dǎo)致元件之間不能協(xié)調(diào)一致地工作，效率大幅降低，或無法實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)功能。因此，設(shè)計(jì)具有良好協(xié)調(diào)行為、協(xié)同執(zhí)行功能的生物系統(tǒng)是合成生物學(xué)的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，也是解決“人造生命”的重要突破口。本文簡(jiǎn)要介紹了近年來非催化元件的研究現(xiàn)狀，重點(diǎn)介紹催化元件設(shè)計(jì)領(lǐng)域從頭預(yù)測(cè)新酶結(jié)構(gòu)的分子優(yōu)化設(shè)計(jì)、人工金屬催化酶設(shè)計(jì)、底物選擇性重設(shè)計(jì)以及酶分子熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì) 4 個(gè)方面的前沿研究進(jìn)展，并綜述了酶分子設(shè)計(jì)與工業(yè)生產(chǎn)的跨層次結(jié)合與技術(shù)互融，以期為合成可控、功能特定的人工生物體系提供重要線索，同時(shí)有助于推動(dòng)合成生物學(xué)關(guān)鍵基礎(chǔ)技術(shù)體系與工業(yè)生物過程的互作發(fā)展。

1 非催化元件設(shè)計(jì)的研究進(jìn)展

自 2005 年啟動(dòng)子庫被引入精細(xì)調(diào)控代謝途徑理念后，多種宿主細(xì)胞（如大腸桿菌、酵母菌以及放線菌等）啟動(dòng)子庫相繼被開發(fā)和被設(shè)計(jì)。隨著大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)特定需求啟動(dòng)子序列，借助人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，人工設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)模型的訓(xùn)練集與測(cè)試集回歸相關(guān)系數(shù)可達(dá)到98%[3]。英國劍橋大學(xué)的 Rackham 與 Chin[4]利用篩選法獲得了正交的核糖體 RNA-mRNA 正交對(duì)。在細(xì)胞內(nèi)，只有當(dāng)兩者都表達(dá)時(shí)，核糖體才能正常地識(shí)別特定的 mRNA 而產(chǎn)生功能蛋白。同時(shí)，他們還利用不同的正交對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)構(gòu)建了更多翻譯水平的邏輯門，為人工設(shè)計(jì)與宿主遺傳背景正交的遺傳線路奠定了基礎(chǔ)。

目前，在生物元件方面已完成了多種不同來源的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)與終止子元件庫的構(gòu)建及預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)度跨度大、梯度密集的元件庫。此外，越來越多新穎的元件不斷被開發(fā)，如核酸開關(guān)（riboswitch）、核酸調(diào)節(jié)子（riboregulator）等順式作用元件，以及轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子（transcription activated-like effector，TALE）、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)等反式元件，為代謝平衡優(yōu)化與復(fù)雜遺傳環(huán)路設(shè)計(jì)提供了堅(jiān)實(shí)保障。如果將非催化元件作為“基礎(chǔ)工具”，那么催化元件可看做“功能工具”，對(duì)實(shí)現(xiàn)代謝途徑高效運(yùn)行具有至關(guān)重要的作用。

2 催化元件設(shè)計(jì)的國際前沿進(jìn)展

催化元件是合成生物學(xué)研究中重要的基本生物元件。雖然在人工合成途徑組裝中可以跨物種應(yīng)用天然酶資源來重構(gòu)特定的代謝途徑，但由于自然界的固有催化特征體系，人工合成往往無法滿足合成生物學(xué)的一些特殊要求，如在異源宿主中表達(dá)量低、生理?xiàng)l件不適應(yīng)、上下游酶活性不匹配等。因此，通過對(duì)催化元件的人工設(shè)計(jì)和組裝來提供具有新功能的元件成為人工合成途徑構(gòu)建的基礎(chǔ)。

目前，利用定向進(jìn)化策略提高催化元件活性、穩(wěn)定性等方面已經(jīng)獲得一定成效。但由于突變體文庫構(gòu)建數(shù)量龐大，并需多輪進(jìn)化，因而定向進(jìn)化策略難以完成對(duì)序列空間的全面搜索。除此之外，突變技術(shù)中固有的密碼子簡(jiǎn)并性和堿基突變傾向性使突變文庫多樣性受到極大限制。隨著高性能計(jì)算技術(shù)發(fā)展，計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)技術(shù)取得了前所未有的發(fā)展，尤其在核心元件酶催化設(shè)計(jì)方面發(fā)揮出巨大作用。利用計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)可根據(jù)反應(yīng)特性以及底物結(jié)構(gòu)等特定研究，定向改造催化元件，并建立全面搜索高精度智能化文庫。這極大程度降低了定向進(jìn)化策略龐大突變體文庫所需的材料成本、時(shí)間成本及人力成本[5]。2016 年，Nature 雜志發(fā)表了題為《全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)時(shí)代來臨》的重要綜述[6]。同年，Science 雜志也將蛋白質(zhì)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)遴選為年度十大科技突破之一。2017 年，美國化學(xué)會(huì)將人工智能設(shè)計(jì)新型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)列為化學(xué)領(lǐng)域八大科研進(jìn)展之首[7]。通過高精度、高效計(jì)算模擬技術(shù)，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、功能設(shè)計(jì)極大程度擴(kuò)展了人工改造生命體的應(yīng)用場(chǎng)景，為現(xiàn)代生物制造帶來全新發(fā)展機(jī)遇。針對(duì)酶的催化功能特性，目前催化元件的計(jì)算設(shè)計(jì)研究主要涵蓋基于結(jié)構(gòu)的從頭預(yù)測(cè)酶分子及后續(xù)優(yōu)化設(shè)計(jì)，基于催化底物的立體選擇性及位置選擇性設(shè)計(jì)，基于金屬催化特性的金屬酶設(shè)計(jì)，以及基于功能特性的熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì)等領(lǐng)域。

2008 年，華盛頓大學(xué) Baker 團(tuán)隊(duì)提出從內(nèi)而外的“Inside-out 策略”，并應(yīng)用該策略設(shè)計(jì)改造了逆醛醇縮合酶[8]、Diels-Alder 反應(yīng)催化酶[9]、Kemp 消除催化酶[10]等一系列酶。然而，盡管從頭計(jì)算新酶設(shè)計(jì)已取得一定成功，“Inside-out 策略”依然存在不同層面的缺陷：① 策略中的模型——theozyme，不能完全反映酶催化過程的真實(shí)過渡態(tài)；② 新酶設(shè)計(jì)需要將催化活性中心與蛋白質(zhì)骨架進(jìn)行嵌合，而嵌合過程難免會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性；③ 在計(jì)算過程中并未考慮長程靜電相互作用及蛋白骨架“誘導(dǎo)-契合”的變構(gòu)影響，經(jīng)過循環(huán)設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化后獲得的酶分子構(gòu)象非常容易陷入能量勢(shì)阱，在相鄰位置可能存在其他極小值。因此，基于“Inside-out策略”設(shè)計(jì)的少數(shù)具有預(yù)期功能的新酶分子初始活性相對(duì)較低，需要通過進(jìn)一步改造來提高酶學(xué)屬性。

隨著量子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)理論及方法學(xué)的發(fā)展，計(jì)算精度不斷提升，計(jì)算尺度逐步擴(kuò)大，相關(guān)算法的通量、靈敏度、選擇性等也有大幅提高。因而，利用量子力學(xué)/分子動(dòng)力學(xué)以及大數(shù)據(jù)分析方法可以快速定位特定功能區(qū)和協(xié)同進(jìn)化位點(diǎn)，為合成生物學(xué)功能器件提供大量精確模板和互作模型。在基于“Inside-out 策略”獲得的新酶基礎(chǔ)上進(jìn)一步推動(dòng)催化元件活性大幅提升，使酶工程技術(shù)迎來發(fā)展新階段，同時(shí)也為發(fā)展符合工程化需求的生物元件設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)規(guī)律。

2.1 從頭預(yù)測(cè)酶分子優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過分子動(dòng)力學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬、量子力學(xué)/分子力學(xué)（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）聯(lián)用方法對(duì)酶分子催化機(jī)理分析，以及對(duì)蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步修飾可大幅提高基于從頭預(yù)測(cè)方法獲得新酶分子的催化活性。例如，在 Kemp 消除反應(yīng)酶分子設(shè)計(jì)中，羧酸基團(tuán)作為廣義堿與非極性底物間相互作用。但是由于羧酸基團(tuán)自由度較大，如果不能準(zhǔn)確計(jì)算羧酸基去溶劑化效應(yīng)的能量消耗及熵減，可能使羧酸基團(tuán)失去廣義堿功能從而導(dǎo)致反應(yīng)無法進(jìn)行。Warshel 課題組通過 QM/MM 經(jīng)驗(yàn)價(jià)鍵（empirical valence bond，EVB）方法預(yù)測(cè)高活性 Kemp 消除反應(yīng)突變體，其結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值比較一致，但與實(shí)驗(yàn)速率常數(shù)推導(dǎo)出的能壘的相關(guān)性較弱[11]。Mayo 課題組計(jì)算迭代方法，以非活性蛋白質(zhì)支架 HG-1 為起始點(diǎn)計(jì)算，迭代校正后獲得的 8 種設(shè)計(jì)酶均表現(xiàn)出顯著的催化活性，大幅提高了計(jì)算設(shè)計(jì)酶分子的成功率[12]。

Diels-Alder 反應(yīng)是雙分子成環(huán)反應(yīng)，自然界中并未發(fā)現(xiàn)能夠催化該反應(yīng)的天然酶分子。2010 年，Baker 研究團(tuán)隊(duì)通過“Inside-out 策略”設(shè)計(jì)了 84 個(gè)可能具有 Diels-Alder 反應(yīng)催化活性的蛋白，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后僅余兩個(gè)蛋白（DA_20 和 DA_42）具有 Diels-Alder 反應(yīng)催化活性[9]。隨后，Baker 團(tuán)隊(duì)通過 Foldit 在線蛋白質(zhì)折疊游戲?qū)念^設(shè)計(jì)的 Diels-Alder 催化酶引入骨架活性以改善骨架結(jié)構(gòu)問題。多名在線貢獻(xiàn)者重塑 DA_20 骨架，使底物與蛋白骨架充分適應(yīng)調(diào)整，從而將 Diels-Alder 催化酶活性提高至少 18 倍[13]。2012 年，Roelfes 課題組在轉(zhuǎn)錄因子 LmrR 孔道末端引入半胱氨酸，共價(jià)連接含有鄰菲羅啉或聯(lián)吡啶基團(tuán)的小分子進(jìn)而與 Cu(Ⅱ) 配位，設(shè)計(jì)出的人工金屬酶具有 97% 的對(duì)映選擇性[14]。

2.2 人工金屬催化酶設(shè)計(jì)

金屬酶在原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)中占有重要地位。自 21 世紀(jì)初開始，人工金屬酶設(shè)計(jì)迅速發(fā)展，并從水解反應(yīng)等天然催化反應(yīng)擴(kuò)展至碳-碳鍵連接、氧轉(zhuǎn)移反應(yīng)等非天然酶催化原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。例如，上述的 Diels-Alder 反應(yīng)中，人工金屬酶催化 Diels-Alder 反應(yīng)的立體選擇性和反應(yīng)活性已與化學(xué)催化劑相當(dāng)。此外，相對(duì)于天然酶，金屬酶的底物范圍明顯增大[15]。2011 年，Kuhlman 課題組偶然發(fā)現(xiàn)，在同源二聚體界面處計(jì)算設(shè)計(jì)的 Zn(Ⅱ) 結(jié)合位點(diǎn)可有效催化羧酸酯和磷酸酯水解[16]。隨后，他們?cè)?rabenosyn 蛋白的 Rab4 結(jié)合域引入組氨酸與 Zn(Ⅱ) 配位，該復(fù)合體對(duì) 4- 硝基苯基乙酸酯的水解速率提升了 5 個(gè)數(shù)量級(jí)[17]。除了活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)優(yōu)化外，化學(xué)連接法也是人工金屬酶設(shè)計(jì)的可行策略。Rovis 課題組讓生物素 Rh(Ⅲ) 配位復(fù)合物與鏈霉親和素結(jié)合，構(gòu)建出用于活化 C-H 鍵的人工金屬酶，催化速率提升了100 倍，并具有 93% 的對(duì)映選擇性[18]。此外，正如 Alexandrova 課題組在綜述中所述，金屬酶進(jìn)化過程除了受反應(yīng)活性等因素影響外，還受金屬可用性和毒性影響[15]。在這些限制因素下，金屬催化劑并非一定達(dá)到其最佳催化性能。因此，利用新型金屬代替固有金屬催化劑改善酶的催化性質(zhì)為金屬酶分子設(shè)計(jì)提供了新思路。Itoh 和 Fujieda[19]在分子動(dòng)力學(xué)模擬的基礎(chǔ)上，利用銅離子取代 β- 內(nèi)酰胺酶的雙鋅離子結(jié)合部分，制備了人工雙銅氧化酶。與野生型 β- 內(nèi)酰胺酶相比，這種銅取代氧化酶的三重突變體催化 4- 叔丁基羧酸酯的 kcat/KM值增加了 87 倍。

2.3 底物選擇性重設(shè)計(jì)

酶催化中心的精確空間結(jié)構(gòu)賦予其高度的底物特異性等特點(diǎn)。面對(duì)紛繁龐雜的底物譜，從自然界中篩選新酶開發(fā)的速度遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)今合成生物學(xué)需求，因此改變酶的底物特異性是計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中應(yīng)用最廣泛的方向之一[20]。

2015 年，Baker 課題組通過計(jì)算設(shè)計(jì)聚甲醛酶，將單碳甲醛分子固定至三碳單元的二羥基丙酮中，從而實(shí)現(xiàn)核心代謝步驟，首次通過催化元件設(shè)計(jì)指導(dǎo)新型代謝通路合成[21]。他們以苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）為起點(diǎn)，利用 RosettaDesign 以及 Foldit 重新設(shè)計(jì) BAL 的苯甲醛結(jié)合口袋以增加其對(duì)甲醛的特異性，獲得 7 個(gè)突變氨基酸組成的聚甲醛酶（Formolase，F(xiàn)LS）。該酶對(duì)聚甲醛反應(yīng)的催化效率與原始 BAL 相比增加 100 倍。在甲酸轉(zhuǎn)化為二羥丙酮磷酸鹽途徑中，由甲酸直接還原為甲醛難度很大。為實(shí)現(xiàn)甲酸轉(zhuǎn)化，Baker課題組先將甲酸活化為甲酰基 -CoA，降低熱力學(xué)障礙。隨后通過 BRENDA 數(shù)據(jù)庫搜索挖掘能夠?qū)⒓柞；?-CoA 還原為甲醛的酰化醛脫氫酶，并將乙酰輔酶 A 合酶與?；┟摎涿复?lián)催化甲酸轉(zhuǎn)化為甲醛。通過上述設(shè)計(jì)的聚甲醛酶，將甲酸最終轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮。這項(xiàng)工作充分證明了酶分子底物重設(shè)計(jì)能夠有效引導(dǎo)新型代謝途徑設(shè)計(jì)。

2.4 酶分子熱穩(wěn)定性設(shè)計(jì)

改善酶熱穩(wěn)定性可提高異源宿主表達(dá)量，提高溫和條件下催化元件活性，并增強(qiáng)酶對(duì)嚴(yán)苛工業(yè)條件（有機(jī)溶劑、高溫、極端 pH 值等）的耐受力。在蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造方面，使用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)進(jìn)化的方法，蛋白質(zhì)熔解溫度的提高通常小于 15℃。而通過對(duì)蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的能量計(jì)算指導(dǎo)的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法則可以突破該局限，甚至可以使蛋白質(zhì)的熔解溫度提高超過 35℃ 以上的水平，獲得具有超熱穩(wěn)定性的蛋白[22]。

目前，針對(duì)酶分子熱穩(wěn)定性改造已發(fā)展出多種策略和算法，其預(yù)測(cè)能量與數(shù)據(jù)庫值擬合程度最高相關(guān)系數(shù)（R 值）可達(dá)到 0.73（Foldx 程序）[23]。Weiss 團(tuán)隊(duì)利用 SCADS 策略（Statistical, Computationally Assisted Design Strategy，SCADS）對(duì)馬兜鈴烯合成酶進(jìn)行環(huán)境能量打分，檢測(cè)氨基酸側(cè)鏈與周圍骨架、側(cè)鏈，以及所在環(huán)境的相互作用[24]。通過環(huán)境能量評(píng)估篩選 12 個(gè)打分最高的氨基酸進(jìn)行突變，熔融溫度由 38℃ 提升至 83℃。Janssen 課題組通過 FRESCO 策略（Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libraries，F(xiàn)RESCO）對(duì)檸檬烯環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性突變體文庫構(gòu)建，通過結(jié)合 10—12 個(gè)單點(diǎn)突變，組合突變體的熔融溫度從 50℃ 提高至 85℃，且酶的催化活性增強(qiáng)，半衰期延長大于 250 倍[25]。他們還利用 FRESCO 策略對(duì)鹵代烷脫鹵酶（haloalkane dehalogenase）LinB 進(jìn)行熱穩(wěn)定性計(jì)算。12 個(gè)穩(wěn)定突變疊加導(dǎo)致 LinB 突變體熔融溫度增加 23℃，并且在 60℃ 下半衰期超過 200 倍[26]。此外，為了提高鹵代醇脫鹵素酶（halohydrin dehalogenase）在有機(jī)溶劑中的耐受性，Janssen 課題組利用 FRESCO 策略確定了 218 個(gè)突變點(diǎn)和 35 個(gè)二硫鍵，具有預(yù)測(cè)的穩(wěn)定效應(yīng)。結(jié)果顯示，組合突變體（HheC-H12）熔融溫度提高 28℃，對(duì)共溶劑的抗性顯著增加[27]。2016 年，F(xiàn)leishman 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種聯(lián)合計(jì)算策略（protein repair one stop shop，PROSS），設(shè)計(jì)帶有 51 個(gè)突變的乙酰膽堿酯酶（hAChE）突變體，通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該突變體可以顯著改善蛋白質(zhì)的核心堆積、表面極性及骨架剛性[28]。與野生型相比，該突變體在大腸桿菌中表達(dá)水平高出 2 000 倍，熱穩(wěn)定性提高 20℃。

多肽的末端功能化對(duì)蛋白質(zhì)生化性質(zhì)具有非常重要的影響。通過對(duì) C 端的特異性修飾可以使多肽的體內(nèi)代謝半衰期延長、免疫原性降低或毒副作用減少。由于多肽結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，化學(xué)修飾步驟多、產(chǎn)率低、難度很大。2016 年，中國科學(xué)院微生物研究所研究團(tuán)隊(duì)與荷蘭格羅寧根大學(xué)以及 Enzypep 公司合作，采取一種“FRESCO 與一致性分析聯(lián)合計(jì)算”策略對(duì)多肽酰胺酶進(jìn)行了工程化改造，成功設(shè)計(jì)了一個(gè)經(jīng)過高度改造的多肽酰胺酶突變體 PAM12A（包含 12 個(gè)突變點(diǎn)）。PAM12A 具有極高的熱穩(wěn)定性（熔解溫度達(dá)到 76℃），并且可以在乙腈、丙酮等多種無水溶劑環(huán)境中保持?jǐn)?shù)天的穩(wěn)定活性[29]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PAM12A 可以催化包括甲酯化、羥胺化、甲胺化、胺化在內(nèi)的多種不同的多肽修飾反應(yīng)，且不受多肽本身序列和 C 端原功能基團(tuán)的限制。

3 酶分子設(shè)計(jì)與工業(yè)生產(chǎn)的跨層次結(jié)合與技術(shù)互融現(xiàn)狀簡(jiǎn)介

近年來，合成生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究及相關(guān)應(yīng)用技術(shù)，如基因組測(cè)序技術(shù)、計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)技術(shù)等以指數(shù)增長的速率發(fā)展。值得注意的是發(fā)達(dá)國家在合成生物學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)領(lǐng)域十分活躍，連續(xù)申請(qǐng)了一系列覆蓋領(lǐng)域很寬的專利，阻止他人進(jìn)入相關(guān)領(lǐng)域[30]。而我國在合成生物學(xué)方面的研究還處于起步階段，待解決的核心問題體現(xiàn)在先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室前沿技術(shù)與工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)對(duì)接能力相對(duì)滯后，技術(shù)融合過程緩慢。諾維信公司（https://www.novozymes.com）作為工業(yè)用酶巨頭，在 2014 年占據(jù)了 44% 的市場(chǎng)份額，是全球工業(yè)酶制劑和微生物制劑市場(chǎng)的絕對(duì)領(lǐng)導(dǎo)者；而美國杜邦公司和荷蘭 DSM 公司分別占有 20% 和 6% 的市場(chǎng)份額。全球各地區(qū)對(duì)工業(yè)酶的需求也呈現(xiàn)巨大差異，歐洲和北美地區(qū)需求量最大，共占據(jù) 80% 市場(chǎng)份額；而中國僅占 9.4%[31]。隨著國家創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)發(fā)展戰(zhàn)略的深入實(shí)施，生物工業(yè)發(fā)展面臨重要發(fā)展機(jī)遇和投資前景。如何建立以合成生物學(xué)技術(shù)和生物-化學(xué)聯(lián)合技術(shù)為核心的低成本生物制造工藝路線，同時(shí)建立促進(jìn)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)體系，將研究機(jī)構(gòu)的研究成果與工業(yè)生物過程同時(shí)兼顧是亟待解決的核心問題。

隨著先進(jìn)制造產(chǎn)業(yè)涵蓋領(lǐng)域與發(fā)展規(guī)模日益擴(kuò)大，生物及交叉應(yīng)用領(lǐng)域不斷涌現(xiàn)出顛覆性創(chuàng)新應(yīng)用，逐漸形成了產(chǎn)品多樣化、產(chǎn)出能力強(qiáng)、市場(chǎng)轉(zhuǎn)化活躍的產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新體系。例如，β- 氨基酸具備多樣的特殊生物活性，被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)牧業(yè)等多個(gè)產(chǎn)業(yè)。β-內(nèi)酰胺抗生素、重磅藥物紫杉醇（重磅抗癌藥物）、西格列汀（糖尿病藥物）及維生素 B5 等多種具有巨大市場(chǎng)銷售額的明星分子均需要 β- 氨基酸作為合成單元。長期以來，β- 氨基酸的合成一直依賴于過渡金屬催化的化學(xué)途徑，需要昂貴的催化劑、繁瑣的保護(hù)與去保護(hù)步驟以及苛刻的反應(yīng)條件。而不對(duì)稱氫胺化反應(yīng)具備極高的原子經(jīng)濟(jì)性，無須附加其他輔劑，是美國化學(xué)會(huì)提出的最具“綠色化學(xué)和綠色工業(yè)”特性的十大反應(yīng)之一[32]。然而，無論是人工設(shè)計(jì)的化學(xué)催化劑或是天然存在的生物催化劑都不能直接催化該反應(yīng)。

中國科學(xué)院微生物研究所研究團(tuán)隊(duì)通過 Rosetta Design 以及高通量 MD 模擬方法對(duì)天冬氨酸酶進(jìn)行了分子重設(shè)計(jì)，成功獲得了一系列具有絕對(duì)位置選擇性與立體選擇性的人工 β- 氨基酸合成酶。該人工設(shè)計(jì)的反應(yīng)體系體現(xiàn)了高效率、高原子經(jīng)濟(jì)性等巨大優(yōu)勢(shì)，底物濃度達(dá)到 300 g/L，實(shí)現(xiàn)了 99% 的轉(zhuǎn)化率，99% 區(qū)域選擇性，以及 99% 立體選擇性，相關(guān)指標(biāo)達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)[33]。該項(xiàng)研究成果為人工智能技術(shù)在工業(yè)菌株設(shè)計(jì)方向的成功案例。除了在科學(xué)層面取得的重要進(jìn)展，該團(tuán)隊(duì)還積極推進(jìn)科研成果的落地轉(zhuǎn)化，通過與企業(yè)的合作，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)通過中試與全尺寸生產(chǎn)工藝驗(yàn)證，在近期完成了千噸級(jí)的生產(chǎn)線建設(shè)。相關(guān)產(chǎn)品有望在紫杉醇、度魯特韋與馬拉維若等抗癌，以及艾滋病治療藥物的生產(chǎn)過程中大幅降低生產(chǎn)成本。

4 結(jié)語

通過世界各國多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的共同推動(dòng)努力，催化元件設(shè)計(jì)已經(jīng)從簡(jiǎn)單的模式化學(xué)反應(yīng)設(shè)計(jì)逐步向具有工業(yè)應(yīng)用前景的催化途徑設(shè)計(jì)發(fā)展。除了可用于單一催化反應(yīng)之外，通過將計(jì)算設(shè)計(jì)的酶整合入復(fù)雜途徑中，還可以創(chuàng)造出全新的代謝途徑，并生產(chǎn)出新型的化學(xué)分子。尤其是由計(jì)算推動(dòng)的催化設(shè)計(jì)領(lǐng)域先導(dǎo)研究，可為合成生物學(xué)的發(fā)展提供自然界中本不存在的全新元件，進(jìn)而極大擴(kuò)展生命的可設(shè)計(jì)性，同時(shí)也為回答酶催化的本質(zhì)機(jī)理以及蛋白質(zhì)的基本折疊規(guī)律等重要基礎(chǔ)科學(xué)問題提供相應(yīng)的支持。