高時空分辨的神經遞質電化學傳感檢測技術發(fā)展與展望

張月月 左小磊 樊春海

胞吐（exocytosis）是神經細胞之間信息交流的基本方式，作為生物體內一項非常重要的生物進程，胞吐以及它的分子機制引起人們廣泛的關注。細胞通過胞吐釋放直徑50～1000 nm的囊泡到環(huán)境中，這些囊泡中的物質組成以及他們的釋放動力學主要取決于細胞的種類和活性狀態(tài)，這也就導致了細胞內部的囊泡在不同時間段、通過不同檢測方式所得到的結果在性質以及數量上存在很大的差異和不均勻性。囊泡膜是由磷脂層構成的復雜結構，其中包含一些跨膜蛋白和來自于細胞膜表面的親水化合物，其非正常釋放會影響相鄰受體細胞的正常生理機能。

磷脂與不同的蛋白、信號復合物發(fā)生作用，調節(jié)囊泡裂變、融合、釋放位點上特異性酶的活性以及蛋白質的運輸和補充。α-突觸核蛋白（α-synuelein）的異常聚集和基因突變與家族性帕金森?。≒D）有密切關系。有報道指出，α-突觸核蛋白通過調控突觸末端的囊泡儲存池來控制囊泡運輸動力學，從而控制在神經遞質釋放期間?？吭诩毎け砻娴哪遗輸盗浚?淀粉樣蛋白也會對阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病存在類似的影響。這些蛋白通常會處于神經細胞末端，在神經遞質釋放中所發(fā)揮的作用尚不明確。但有些研究表明，在神經細胞或者嗜鉻細胞中，這些蛋白的表達量提高會導致囊泡融合孔擴大從而加速囊泡的釋放，降低胞吐釋放事件的數目。tau蛋白在病理狀態(tài)下會產生累積，引起突觸前端功能障礙，進而導致肌動蛋白聚合，使得囊泡之間產生交聯(lián)并抑制囊泡在細胞膜上面的停靠，導致細胞無法正常胞吐釋放以及疾病發(fā)生。

綜上所述，能夠及時、準確、快速地對胞內囊泡及其釋放情況進行檢測，是近些年來神經科學領域面臨的一個非常重大的問題。電化學技術由于其快速便捷的特點，可以實現(xiàn)對生物系統(tǒng)中快速胞吐釋放過程的實時定量分析，大幅度提高疾病早期檢測的能力，其中微電極電化學能夠在實現(xiàn)單細胞監(jiān)測的基礎上提升檢測的靈敏度、特異性以及抗干擾能力。但是，由于胞吐囊泡通常比較?。ㄖ睆揭话銥?0～100 nm）且聚集狀態(tài)不固定，亟需一種更高分辨率的技術來優(yōu)化檢測效率與分辨率之間的關系。在這方面，納米電化學技術的出現(xiàn)為納米尺度囊泡的傳感檢測帶來了新機遇，納米電化學技術與生物傳感技術的有機結合，可以在深入研究納米尺度囊泡碰撞作用機制的基礎上，針對生物傳感領域面臨的挑戰(zhàn)性問題，達到單囊泡、單分子水平的分析，實現(xiàn)高靈敏度、高特異性以及高時空分辨率的檢測。

1 微電極監(jiān)測機理

信息以極快的速度通過神經突觸進行傳輸，大多數突觸的傳遞時間雖然只有幾毫秒，但是這個速度對于大腦的整體運作至關重要。當動作電位沿軸突末梢傳導時，它會使神經末梢去極化并打開突觸前膜的Ca2+通道，Ca2+內流后1 ms內觸發(fā)神經遞質釋放。

突觸前端的神經遞質釋放是膜介導的，突觸前端內部充滿囊泡，尺寸不等（30～100 nm），每個囊泡中包含高濃度的神經遞質。當Ca2+誘發(fā)囊泡膜與突觸前端細胞膜的特異性區(qū)域（俗稱活性區(qū)域）快速融合的同時，釋放發(fā)生?；钚詤^(qū)域通常位于突觸后端包含神經遞質受體較為密集方位的對面區(qū)域。囊泡在整個突觸前端的膜運輸循環(huán)過程包括：（1）突觸前端循環(huán)囊泡形成，以及填充神經遞質（NT）；（2）囊泡運輸到接近突觸前端細胞膜的位置，并在此聚集等待胞吐發(fā)生；（3）在囊泡膜上的蛋白以及細胞膜活性區(qū)域蛋白的共同作用下，囊泡?？坎⒈豢刂圃卺尫呕钚詤^(qū)域；（4）囊泡處于待融合階段；（5）Ca2+引發(fā)融合孔打開，神經遞質釋放。胞吐過程中，囊泡存在不同的釋放方式，包括：囊泡完全與細胞膜融合的全釋放模式，融合孔閃爍開關導致的“kiss and stay”（部分融合且停留）模式，以及依賴于網格蛋白的“kiss and run”（部分融合即離開）模式。

神經遞質釋放過程包含了復雜的物理化學過程，亦有不同檢測方法。本文針對不同的胞吐釋放模式，以碳纖維納米電極對細胞胞吐的實時監(jiān)測為例進行介紹。理想狀態(tài)下，外界對單細胞某個部位施加刺激，使細胞表面活性區(qū)域的囊泡發(fā)生釋放，囊泡中的分子碰撞到位于細胞表面的電極界面，在一定氧化電壓的作用下失去電子發(fā)生氧化。同時，電化學設備將這種失電子行為轉化為電信號輸出。在細胞內部的監(jiān)測中，電極表面存在一些羧基官能團，由于靜電吸引作用，這些羧基官能團容易與親水性的囊泡發(fā)生碰撞，導致囊泡破裂同時釋放出其內部的分子，而這些分子在電極表面發(fā)生氧化。

因此，碳纖維納米電極在納米囊泡監(jiān)測方面的應用，不僅克服了電極與細胞內蛋白之間的非特異性吸附，同時也提高了檢測的分辨率和靈敏度。神經細胞內部囊泡中包含各種不同類型的神經遞質，包括多巴胺、羥色胺、腎上腺素、去腎上腺素等，嗜鉻細胞中囊泡主要包含多巴胺，而巨噬細胞中則包含一些活性氧以及活性氮成分，這些分子都很容易發(fā)生氧化。在監(jiān)測過程中，只有超過監(jiān)測對象的氧化電壓才能將其氧化，并產生電化學信號。通過調整電極所加電壓或者細胞類型來控制可檢測的分子種類，通過在電極表面修飾特定分子增加電極與待測對象之間的相互作用力，均可使檢測具有更高的靈敏度、特異性以及更低的檢測限。

影響胞吐釋放的因素也是多種多樣的，研究人員通常對細胞作一系列處理來控制細胞釋放分子的數量或釋放事件的多少。比如：利血平可以使囊泡釋放分子數減?。籐-DOPA作為多巴胺的前體，可以增加釋放的分子數；順鉑在不同濃度下對細胞釋放的影響有顯著差別，高濃度抑制，低濃度促進，這可能與細胞內的某種蛋白作用有關；鋅離子不會改變釋放分子數，但是它會使融合孔減小，改變釋放動力學的速度，并引起更高的釋放比例。單個囊泡的電化學信號非常微弱，在皮安（pA）級別，很容易導致信號湮沒，因此在監(jiān)測過程中合理選用處理細胞的方法對于細胞實時監(jiān)測來說同樣重要。

2 基于高時空分辨率的囊泡檢測方法

關于細胞的實時監(jiān)測，現(xiàn)在最普遍的方法是成像，但是成像方法雖然比較直觀，也存在諸多挑戰(zhàn)，例如：細胞胞吐釋放神經遞質的實時監(jiān)測，成像技術在時間以及空間分辨率上還存在一定的局限性。對于單細胞而言，特別是在神經科學中神經遞質的釋放研究中，微電極的應用已經相對成熟。微電極相對于宏觀尺寸電極而言具有更小的尖端尺寸以及更高的靈敏度，非常適合單細胞研究，現(xiàn)在已經成功應用于檢測蛋白、小分子以及一些離子和病毒等。Wightman等最先開展通過電化學方式進行細胞胞吐的實時監(jiān)測工作，通過制備直徑為2 μm的碳纖維微米電極，監(jiān)測嗜鉻細胞表面若干個微米區(qū)域的胞吐釋放情況。后來，越來越多的研究者針對不同種類的細胞以及人工制備的囊泡進行檢測并加以分析。近些年隨著囊泡檢測工作的不斷進行，檢測對象也在發(fā)生變化，從最初的單細胞到單囊泡以及單分子。與此同時，檢測方式也在發(fā)生變化，逐漸影響了檢測的分辨率以及靈敏度。

2.1 微米電極

微米電極尺寸在微米級別，尖端足夠覆蓋整個細胞體，具有高的信噪比，可以測量非常小的電流強度并保證監(jiān)測的效率。在細胞以及活體檢測中所用的微米電極主要有金屬電極和碳纖維電極兩種，其中碳纖維微米電極是微電極中非常重要的一個組成部分，自從應用以來，微電極伏安法就被認為是研究大腦中神經遞質傳遞的一項不可或缺的技術，一直在生物學領域發(fā)揮重要作用。通過碳纖維微米電極，可以從單細胞水平對神經遞質的釋放進行監(jiān)測。

通過微電極電化學檢測單細胞釋放事件是非常強有力的方法，它可以實時監(jiān)測分子釋放過程并且提供囊泡釋放事件的動力學信息，實現(xiàn)在單細胞水平的定量分析。傳統(tǒng)微米電極使用環(huán)氧樹脂封閉玻璃管尖端，然后用膠體石墨回填玻璃管，該方法存在4個缺點：（1）會導致玻璃/碳纖維的接觸面都存在環(huán)氧樹脂，嚴重影響了電極性能；（2）不可避免的封閉不完全甚至泄露，會導致低信噪比、低靈敏度、低電極壽命以及液體污染；（3）不能保證膠體石墨的填充成功率，電極制作成品率比較低；（4）環(huán)氧樹脂可以溶解在有機溶劑中，因而不能在有機溶劑中監(jiān)測或者進行特殊修飾。為了克服這些缺點，Strein和Ewing、Malinski和Taha用火焰刻蝕法制備電極。但是，電極尖端仍然存在環(huán)氧樹脂，增加了刻蝕難度并且難以調控刻蝕進程，電極表面不夠平滑。在此方法的基礎上，黃衛(wèi)華課題組報道了一種新的改進方式，其中沒有環(huán)氧樹脂對尖端的處理，通過火焰熔融將玻璃管和碳纖維融合在一起，形成了比較高效的封閉，這樣制備的電極尖端比較平滑，具有很好的電化學特性，電化學檢測中檢測靈敏度高，主要應用于監(jiān)測細胞胞吐釋放神經遞質以及活體研究。

細胞釋放有很多種模式，要正確判斷當前的模式種類，需要分別對細胞內部囊泡以及細胞胞吐釋放的囊泡進行監(jiān)測。對細胞內囊泡中分子的準確定量，最常用的方法是將細胞裂解后進行檢測。細胞裂解釋放和超速離心分離出囊泡，然后通過微米電極進行電化學檢測，檢測結果可以得到若干個信號峰，而其中每個峰都代表一個囊泡的碰撞破裂后的氧化事件。很多研究都發(fā)現(xiàn)，胞吐過程中，囊泡僅僅釋放一部分神經遞質，剩余未釋放部分以另一種形式循環(huán)或者繼續(xù)釋放，而神經細胞中大多為“kiss and run”模式。

微電極在活體檢測中的應用已經有幾十年的歷史，將碳纖維微米電極或者鍍金的微電極通過顯微操控技術置于小鼠大腦中進行實驗，可以在整個時間范圍內進行高靈敏檢測。這種設計被廣泛應用于神經生物學中，尤其是紋狀體中多巴胺的檢測。最初Adams研究發(fā)現(xiàn)活體電化學分析技術非常適用于實時監(jiān)測大腦中的神經遞質。后來，很多研究人員也對大腦中多種神經遞質（羥色胺、多巴胺等）進行檢測并分析。

2.2 納米電極

化學突觸之間信息的正常傳遞對于腦功能運行具有非常重要的作用。突觸是由突觸前端、突觸后端以及之間的間隙（20～50 nm）組成。納米尺度的間隙使得實時監(jiān)測細胞之間神經遞質的突觸釋放成為巨大的挑戰(zhàn)。在過去很多年里，人們很少關注到電極尺寸和電極表面的幾何形狀對電化學過程帶來的影響，以及尺寸和檢測信號之間的直接性關系。細胞大小通常在幾微米到幾十微米之間，每個細胞中包含上千個納米級別的囊泡，每個囊泡中儲存著大量的信息傳遞分子。傳統(tǒng)的微米電極可以反映整個細胞表面一部分區(qū)域的胞吐特性，但是并不適用于區(qū)分每一個單獨釋放位點的性質，也不能探測納米尺寸突觸間隙之間神經遞質釋放的機理。納米電極的發(fā)展為高分辨率的檢測帶來了機遇，很多報道已經指出了小尺寸的納米電極在神經科學以及生命科學中的應用潛力。

胞吐實時監(jiān)測過程中，納米電極與細胞之間的距離控制在5 μm以內，這樣能夠最小化擴散產生的影響。通過人工模擬細胞以及囊泡發(fā)現(xiàn)，細胞膜與電極之間的距離會影響單囊泡釋放的瞬時電流。假如囊泡尺寸比電極小且囊泡融合區(qū)域沒有靠近電極表面邊緣區(qū)域，則我們假設的定量氧化行為完全有效，但是現(xiàn)實監(jiān)測中往往沒有如此精確。監(jiān)測過程中，神經遞質通過流動和擴散到達膜外區(qū)域，它們從釋放位點釋放并呈半球幾何形狀稀釋并碰撞氧化。在此過程中，大電極可以有效封阻分子在X軸方向上面的傳遞，只能在膜和電極之間移動，檢測效率非常高。但是，電極增加會大大降低電極的時間和空間分辨率，以至于難以區(qū)分單一囊泡和多個囊泡聚集體的情況。因此，選擇一種與囊泡相匹配的電極，并調控好檢測效率與時空分辨率之間的關系，在細胞監(jiān)測中是重要且具有挑戰(zhàn)性的問題。

利用碳纖維納米電極進行實時監(jiān)測可以得到囊泡中分子的定量化信息以及動力學參數。一個正常的信號峰是由峰腳、上升階段和下降階段組成。峰腳是囊泡與細胞膜開始融合階段，此時融合孔比較小，因此釋放速度比較慢；上升階段是融合孔張開，大規(guī)模釋放神經遞質并氧化的過程，初期因為囊泡中遞質含量比較高，通常上升階段比較陡峭；下降階段是囊泡監(jiān)測后期，分子濃度降低，氧化進程變慢，表現(xiàn)為比較平緩和更延展的曲線形式，通過對信號峰進行積分以及數學運算可以得到囊泡尺寸、包裹分子數以及分子濃度信息。半峰寬為峰高一半時候的峰寬度，表明囊泡從釋放初始階段到釋放完畢速率的大小，是釋放動力學的體現(xiàn)，半峰寬的大小與監(jiān)測囊泡大小及內部包裹神經遞質的量直接相關。

納米電極研究表明，細胞表面存在活性區(qū)域和非活性區(qū)域，而其中大部分表面都是非活性的。同時在活性區(qū)域還存在特殊活性位點，同一個位點可能存在多個囊泡連續(xù)釋放的情況，只有納米電極恰好處于活性位點位置時才能監(jiān)測到信號。黃衛(wèi)華課題組首次報道了通過納米電化學方法，利用納米電極在同一釋放位點監(jiān)測到多個囊泡釋放出多巴胺的情況，這主要歸因于納米電極的高分辨率，可以區(qū)分多個囊泡連續(xù)釋放。后來他們又對神經細胞之間連接部位的神經遞質釋放進行監(jiān)測并分析，得到囊泡中分子含量以及釋放動力學方面的信息。納米電極尖端尺寸只有100 nm左右，既滿足了與囊泡之間的匹配性質，穿透細胞膜的同時又不會對細胞造成傷害。因此，納米電極在外部監(jiān)測的同時，還可以實現(xiàn)對細胞內部囊泡的實時監(jiān)測。Majdi等通過碳纖維納米電極穿透細胞膜檢測了單細胞內部囊泡中的神經遞質含量，并將之與外部監(jiān)測對比，發(fā)現(xiàn)胞吐釋放的量確實少于囊泡中實際量，當然胞外擴散也占一定的比重。相對于細胞裂解的方法，現(xiàn)在可以直接在細胞環(huán)境中進行檢測，這是一種更為準確和直接的對細胞內囊泡中分子定量的手段。金屬電極在納米電極中也占了很大的比重，如施國躍等用金納米電極（尖端尺寸3 nm）對細胞的胞吐釋放進行研究。金電極電子傳輸速率快，檢測靈敏度高，但是也容易吸附細胞內部的復雜蛋白，造成污染，嚴重影響電極壽命。目前，碳纖維納米電極在單細胞乃至單囊泡檢測領域仍占有至關重要的地位。

2.3 其他聯(lián)用技術

納米電極具有很高的空間分辨率以及與胞吐釋放動力學相匹配的毫秒級別以下的時間分辨率，但是缺乏一定的直觀性，無法準確定位細胞表面的釋放位點；微流控具有很好的控制性能，但是分辨率通常比較低；全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）具有一定的空間分辨率，借助熒光可以實現(xiàn)囊泡釋放位點的追蹤，卻缺乏探索動力學參數以及定量分析所需要的時間分辨率，另外其他的一些細胞監(jiān)測手段也同樣存在優(yōu)勢和局限性?？紤]到這些方法之間的互補性，如果將兩種或兩種以上的技術聯(lián)用，就能夠更直觀且高分辨率的對胞吐事件進行監(jiān)測。

微流控通量高，通過設計通道寬度，檢測限可以達到單細胞水平；而電化學檢測方法靈活性強，兩者與碳纖維微電極聯(lián)用，可對細胞中裂解的囊泡進行快速檢測。因為檢測過程中囊泡會不斷碰撞到電極表面，檢測效率高。將TIRFM與微流控芯片以及電化學技術相結合，可以通過記錄熒光強度來觀察囊泡分泌過程，通過對比產生的氧化電流峰的不同對整個釋放事件定量，兩者相關聯(lián)能夠獲得具有高時空分辨率并且可視化的表征。

基于等離子體的電化學阻抗成像技術，將等離子體成像與電化學阻抗結合在一起，能夠在不需要標記的情況下對神經細胞在刺激狀態(tài)下的動作電位成像。同時，簡化了樣品準備時間，并且排除在神經細胞上面標記熒光基團對相關功能帶來的不良影響，可以與傳統(tǒng)的膜片鉗以及熒光顯微鏡相媲美。

掃描電化學顯微鏡（SECM），是一種掃描探針顯微技術，利用高分辨率的微電極作為測量工具，已經應用于細胞的新陳代謝、呼吸作用以及細胞膜對化學試劑的滲透作用等研究，并且能夠作用于單個細胞。研究過程中盤狀微電極放置在一個包含氧化還原物質的溶液中，在超過其氧化電壓的條件下，能夠得到典型的S型循環(huán)伏安曲線和穩(wěn)態(tài)電流。電極位于非?？拷鼧悠返奈恢茫鶕悠沸再|的不同分為負反饋和正反饋，得到微電流減小或增大的曲線。而反饋的程度取決于電極與細胞之間的距離，可以同時對細胞表面的形態(tài)以及釋放的化學分子進行掃描。

綜上所述，聯(lián)用技術可以發(fā)揮多種不同檢測手段的優(yōu)勢，克服單一技術的不足，也將是未來檢測發(fā)展的一種主流趨勢。

3 總結與展望

近些年來，人們已經發(fā)展了多種檢測方法，包括微流控、微米電極、納米電極、熒光、高效液相色譜、TIRFM、SECM 等。其中，電化學方法具有快速、便捷、檢測效率高以及靈敏度高等特點，應用最為廣泛。細胞內部囊泡尺寸非常小，隨著技術的不斷進步，單純熒光的方法已經不足以滿足研究的需求，納米電極的出現(xiàn)為囊泡的高時空分辨率傳感檢測創(chuàng)造了條件。納米電極尖端尺寸非常小，并且能夠可控的進行調整，可以與囊泡達成很好的匹配性，在不損失分辨率的狀態(tài)下盡量保持高的檢測效率，實現(xiàn)真正意義上的單囊泡檢測。同時，納米電化學技術還可以提供較為詳細的分子數、濃度以及尺寸等定量化信息，通過調整電極表面所加電壓，來調控檢測的分子種類。基于高時空分辨率的實時監(jiān)測以及可視化的需求，監(jiān)測方式不再只是局限于單一的某種技術，迫切需要發(fā)展多種技術聯(lián)用方法，在滿足分辨率的同時又能直觀觀察到目標所在的具體方位。為了能夠適應當前需求，未來繼續(xù)發(fā)展高分辨率的成像技術，并且在納米電極制備方面進行更精確的調整，實現(xiàn)檢測過程可視化，檢測結果定量化，并能將其一一對應。