缺氧條件下GDF—15對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響

尚小森++衛(wèi)兵艷++劉田福++陳小平

【摘要】目的 通過缺氧發(fā)生裝置將心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）進(jìn)行缺氧，轉(zhuǎn)染GDF-15相關(guān)病毒，觀察其對CMECs成管的影響。方法 將CMECs分為五組：空白對照組、GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組、干擾對照組、過表達(dá)GDF-15組、過表達(dá)對照組，以上各組在缺氧發(fā)生裝置中進(jìn)行缺氧干預(yù)，Western blot測定各組細(xì)胞GDF-15蛋白的表達(dá)情況。通過內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗，觀察各組在缺氧條件下CMECs管腔結(jié)構(gòu)形成情況。結(jié)果 過表達(dá)組較其他組GDF-15蛋白表達(dá)明顯增加，干擾組明顯降低，缺氧條件較常氧，CDF-15表達(dá)增高。缺氧6h時CMECs過表達(dá)GDF-15組在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)，而GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組及對照組均未形成管腔結(jié)構(gòu)。結(jié)論 缺氧條件能促進(jìn)CMECs中 GDF-15的表達(dá)，GDF-15能夠促進(jìn)CMECs增殖及血管新生，為GDF-15在急性心肌梗死側(cè)支循環(huán)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】急性心肌梗死；側(cè)支循環(huán)；心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；生長分化因子-15

【中圖分類號】】R363 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2017.31..03

Explore the effects of GDF - 15 on the myocardial microvascular endothelial cells into a tube under hypoxia

SHANG Xiao-sen1，WEI Bing-yan2，LIU Tian-fu2，CHEN Xiao-ping1*

（1.Department of Cardiology， Taiyuan Central Hospital，Shanxi Taiyuan 030009，China；2.Laboratory Animal Center， experimental animal and human disease animal model Shanxi Key Laboratory， Shanxi Medical University，Shanxi Taiyuan 030001，China.）

【Abstract】Objective Through hypoxia generator make myocardial microvascular endothelial cells hypoxia， transfect GDF-15 virus， Observe its effects on CMECs into tube.Methods CMECs can be divided into five groups： blank control group， GDF-15siRNA group， control group of interfere， overexpression of GDF - 15 groups， control group of overexpression. Put the above groups into hypoxia generator ；By using Western-blotting to evaluate the expression of GDF-15 under the hypoxia condition. By endothelial cells into tube experiments，observe CMECs lumen structure formation of each group.Results Overexpression group than other group GDF - 15 protein expression significantly increased， interference group significantly decreased， and the expression of GDF-15 under hypoxia is higher than oxygen condition. CMECs of overexpression group lumen structure formated in hypoxia 6h， opposite to GDF-15siRNA and other control groups.Conclusion Hypoxia conditions can promote the expression of GDF–15 of CMECs，GDF-15 can promote the proliferation and formation of collateral circulation of CMECs.It laid a foundation for the research of GDF-15 on collateral circulation in acute myocardial infarction.

【Key words】Acute myocardial infarction；Coronary collateral circulation；CMECs；GDF-15

目前，人們在精神及生理方面承擔(dān)著越來越大的壓力與責(zé)任，這與當(dāng)今社會逐漸加快的工作節(jié)奏密不可分，冠狀動脈疾病也隨之逐漸增多，給國家?guī)砭薮蟮纳鐣?fù)擔(dān)，并造成嚴(yán)重的醫(yī)療資源消耗及勞動力損失。其中，急性心肌梗死則為頭號殺手，它是由于冠狀動脈血管壁的痙攣或狹窄、閉塞所致，隨病情進(jìn)展，嚴(yán)重時可致心力衰竭[1]。急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction AMI），是在冠狀動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生冠脈急性血栓栓塞所致。對于冠心病，尤其是急性心肌梗死的有效預(yù)防和及時治療已成為目前心血管疾病領(lǐng)域的重要研究課題。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（AMI）冠脈血流閉塞時，尤其是發(fā)病3～6 h內(nèi)的心?；颊?，其側(cè)支血管的形成對梗死面積的大小起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，良好的側(cè)支循環(huán)可以維持AMI相關(guān)區(qū)域心肌的活性，可有效保護(hù)心功能，對患者的臨床預(yù)后及生活質(zhì)量有極大的改善[2]。新生血管是維持病理或正常組織血液供應(yīng)的重要機(jī)制之一，在急性心肌梗死時，對心肌細(xì)胞缺血、缺氧所產(chǎn)生的癥狀亦具有明顯改善作用，其中，側(cè)支循環(huán)的建立則尤為重要[3]。并且它是心肌以及其他臟器對于組織缺血產(chǎn)生的應(yīng)答和自我保護(hù)機(jī)制。endprint

2006年發(fā)表在Circulation Research的兩項研究首先報道了生長分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF-15），TGF-β超家族成員之一，在缺血性心臟疾病中發(fā)揮著重要的保護(hù)機(jī)制[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15參與了缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion）損傷后缺血心肌的修復(fù)。隨后，大量報道顯示：GDF-15是多種心源性疾病重要的診斷marker和預(yù)后指標(biāo)，故此，在缺血缺氧微環(huán)境中的GDF-15水平變化，以及GDF-15如何調(diào)控心肌細(xì)胞存活，血管新生以及改善心臟功能的基礎(chǔ)方面驗證研究尚不明確。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國的Gibco公司；GDF-15 siRNA慢病毒、過表達(dá)GDF-15慢病毒購于Elabscience生物科技有限公司；Anti-GDF15抗體（兔單克隆抗體）抗體購于美國abcam公司；GDF-15引物及β-actin引物均于美國Gene Copoeia公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞來源

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取CMECs復(fù)蘇后在37℃下、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法，按1∶3分瓶傳代。

1.3.2 細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染及分組

CMECs分5組：正常CMECs為空白對照組、GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組、干擾對照組、過表達(dá)GDF-15組、過表達(dá)對照組。轉(zhuǎn)染8 h后將各組細(xì)胞換液，每組各加2ml高糖完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)染72 h后用嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞、傳代。再將以上5組分為細(xì)胞缺氧模型制備組及常氧組。

1.3.3 Western blot測定各組細(xì)胞在常氧及缺氧6h GDF-15蛋白表達(dá)情況

處理后的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗干凈，用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，12000×g離心25 min（4℃），收集上清液。BCA法測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%的濃縮膠和15%的分離膠進(jìn)行跑膠，轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉2 h，一抗4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，二抗室溫孵育2h，TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，洗凈，顯色，掃描。

1.3.4 CMECs體外成管實(shí)驗

用預(yù)冷的槍頭將基質(zhì)膠在冰上以每孔50 μl鋪于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，之后每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液（2×104/孔）。按照5個分組處理細(xì)胞6 h后，觀察各組細(xì)胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度，并隨機(jī)選取5個視野，應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野小管數(shù)量，結(jié)果以與正常組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 各轉(zhuǎn)染組CMECs72 h后的生長情況如下圖所示

GDF-15過表達(dá)組細(xì)胞生長明顯比其他組快，GDF-15siRNA組明顯比其他組慢。

2.2 對各組細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，如下圖所示

觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧12 h時90%以上細(xì)胞已壞死，因此取缺氧時間點(diǎn)為6 h。

2.3 常氧及缺氧6 h，各組GDF-15的表達(dá)情況

進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染后，觀察常氧及缺氧6 h時各組細(xì)胞GDF-15蛋白的表達(dá)情況：GDF-15過表達(dá)組實(shí)現(xiàn)了GDF-15過量表達(dá)，GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組實(shí)現(xiàn)了GDF-15的低表達(dá)，且缺氧后各組GDF-15蛋白表達(dá)量較常氧時均有所增加，缺氧刺激了GDF-15的表達(dá)。

2.4 缺氧6h時，CMECs成管實(shí)驗結(jié)果

GDF-15過表達(dá)組的CMECs細(xì)胞在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)，而GDF-15siRNA組及對照組均未形成管腔結(jié)構(gòu)。

3 討 論

心肌梗死（Myocardial Infarction MI），是心肌缺血性壞死，是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久缺血導(dǎo)致心肌壞死。急性心肌梗死（AMI）可發(fā)生心律失常、休克或心力衰竭，屬急性冠脈綜合征的嚴(yán)重類型。如何有效地預(yù)防及治療冠心病，特別是急性心肌梗死，已成為目前心血管疾病研究的重要領(lǐng)域。在我們前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，GDF-15具有促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)形成的作用，本研究根據(jù)體內(nèi)急性心肌梗死時的組織缺氧環(huán)境構(gòu)建缺氧發(fā)生裝置，驗證GDF-15能否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生。在實(shí)驗過程中發(fā)現(xiàn)：與缺氧6 h相比，當(dāng)缺氧2 h時，各組均未出現(xiàn)較明顯的實(shí)驗結(jié)果；缺氧12 h時，約90%的細(xì)胞發(fā)生壞死；因此選擇缺氧6 h的時間點(diǎn)進(jìn)行觀察與研究。

Western blot實(shí)驗表明：病毒轉(zhuǎn)染后，GDF-15過表達(dá)組實(shí)現(xiàn)了GDF-15高表達(dá)，GDF-15siRNA組實(shí)現(xiàn)了GDF-15低表達(dá)。缺氧條件下各組GDF-15較常氧組表達(dá)量增多，說明缺氧可能是GDF-15的一個刺激因素。

內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗表明：觀察缺氧6 h時各組在Matrigel Matrix的成管情況，過表達(dá)GDF-15組較空白對照組細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)達(dá)90%以上，GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗證明，GDF-15可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管，可能為改善缺血心肌的局部血液循環(huán)，促進(jìn)血管新生以及側(cè)枝建立等起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，GDF-15具有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并形成管腔的作用，從而進(jìn)一步的闡明了GDF-15可以促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)的形成，為缺血性心臟病及急性心肌梗死疾病的預(yù)防及治療運(yùn)用提供安全性必要保障。在下一步的研究中，我們將從細(xì)胞和動物模型水平兩方面對GDF-15是如何促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)的形成及其作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 顧會平，吳明煜，郭曉紅.姜黃素對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其與Toll樣受體4/核因子 B信號通路的相關(guān)性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2016，9（29）：932-935.

[2] Andrew P， Patrick J，Bradford G，et al.Identification of a plasma metabolomic signature of thrombotic myocardial infarction that is distinct from non-thrombotic myocardial infarction and stable coronary artery disease[J].PLoS One，2017，12（4）：91-98.

[3] Koushik R，Asma K，and Robert J H.Recent advances in the diagnosis and treatment of acute myocardial infarction [J].World J Cardiol，2015，7（5）：243-276.

[4] 宋和鑒.生長分化因子15（GDF-15）對缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管新生的影響及機(jī)制的研究[M].2014，5：2-4.

本文編輯：吳宏艷endprint