個(gè)體化新生抗原疫苗：癌癥免疫治療的新途徑

■ 文 /閻 影

當(dāng)今癌癥免疫的機(jī)理許多還不十分清楚，癌癥免疫治療的春天只是剛剛開始。

癌癥免疫治療應(yīng)用研究已有將近130年的歷史。癌癥免疫領(lǐng)域的先驅(qū)者、美國(guó)醫(yī)生威廉·科利（William Coley）早在1893年就開始采用由化膿性鏈球菌制備的丹毒細(xì)菌毒素（后來(lái)被稱為“科利毒素”或“科利疫苗”），反復(fù)接種給晚期癌癥患者，刺激發(fā)熱和機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使一些患者的腫瘤消退。這項(xiàng)開創(chuàng)性早期工作首次提供了接種抗原性物質(zhì)可能刺激人體免疫系統(tǒng)，達(dá)到臨床上明顯抑制腫瘤增長(zhǎng)的直接證據(jù)。

此后，癌癥免疫治療經(jīng)歷了漫長(zhǎng)艱辛的發(fā)展，科利本人和他的“疫苗”也經(jīng)歷過(guò)許多艱難的困境與挫折。直到最近幾年，癌癥免疫治療領(lǐng)域出現(xiàn)的兩個(gè)里程碑式的進(jìn)展：嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞（CAR-T）和免疫核查點(diǎn)信號(hào)阻斷抗體PD-1/PD-L1的創(chuàng)新和臨床應(yīng)用，使癌癥免疫治療真正走上了臺(tái)面，成為繼手術(shù)、化療、放療和靶向治療后又一種癌癥治療方法，并有希望成為癌癥治療的最重要手段。治療性癌癥疫苗領(lǐng)域經(jīng)過(guò)百年的積淀，最近也獲得了重要進(jìn)展。個(gè)體化新生抗原（neoantigen）癌癥疫苗的開發(fā)和應(yīng)用，成為癌癥免疫治療的又一條新途徑。

癌癥疫苗

近代癌癥疫苗的研發(fā)也有幾十年了。但是，迄今為止，僅有個(gè)別產(chǎn)品進(jìn)入臨床應(yīng)用。例如人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗，這種預(yù)防性癌癥疫苗只是對(duì)與病毒感染相關(guān)的癌癥具有療效。前列腺癌疫苗（Sipuleucel-T）是目前唯一得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用的治療性疫苗，實(shí)際上這種疫苗也只能達(dá)到邊緣性的臨床效果?？傮w而言，與其他免疫療法比較，尤其是PD-1和T細(xì)胞治療，絕大多數(shù)治療性癌癥疫苗并沒(méi)能證明具有顯著的臨床療效。

以往，大多數(shù)癌癥疫苗多使用腫瘤相關(guān)抗原（Tumor associated antigens，TAAs)作 為 免 疫原。這些TAAs本質(zhì)上是非突變的自身抗原（selfantigens），存在于正?；蚪M中。TAAs通常在人體正常細(xì)胞中以相對(duì)低水平表達(dá)的狀態(tài)存在，而在癌癥組織中表現(xiàn)為過(guò)度表達(dá)。接種以TAAs為基礎(chǔ)的癌癥疫苗的目的，在于激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)TAAs的免疫反應(yīng)，主要是激活T細(xì)胞，殺滅和清除表達(dá)該TAAs抗原的癌細(xì)胞。

然而，TAAs疫苗作為機(jī)體正常存在的自身抗原，在臨床應(yīng)用上存在兩個(gè)主要的問(wèn)題。首先，由于自身抗原在體內(nèi)的存在可以造成免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中樞性耐受（Central Tolerance）。換句話說(shuō)，免疫系統(tǒng)不把這些自身抗原當(dāng)作異物處理，因此，不產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其次，在某種條件下，如果誘發(fā)了針對(duì)TAAs的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，有可能造成自身免疫（autoimmunity）異常。上述因素可能是導(dǎo)致TAAs自身抗原疫苗臨床療效不明顯和出現(xiàn)不良反應(yīng)的主要原因。因此，一些學(xué)者認(rèn)為，選擇和開發(fā)基于基因突變產(chǎn)生的癌癥特異性抗原疫苗，可能是解決與TAAs有關(guān)的中樞耐受和自身免疫問(wèn)題的重要途徑。

獨(dú)有新生抗原制備的癌癥疫苗只能特異性地、一對(duì)一地針對(duì)每個(gè)個(gè)體患者或腫瘤，從這種意義上來(lái)說(shuō)，這是真正的、純粹的個(gè)體化治療。

新生抗原

癌癥新生抗原是體細(xì)胞突變的產(chǎn)物。這些癌癥特異性抗原可以來(lái)自病毒蛋白、基因翻譯后的修飾或體細(xì)胞突變（如點(diǎn)突變、插入和缺失、開放閱讀框架改變等）。癌細(xì)胞中普遍存在的基因突變及其產(chǎn)物是健康細(xì)胞和正?；蚪M中所沒(méi)有的，它們不僅是特異性癌癥抗原，而且由于不存在中樞性耐受的基礎(chǔ)環(huán)境，可能具有高度免疫原性，具備構(gòu)建癌癥疫苗的理想條件。雖然對(duì)癌癥新生抗原的認(rèn)識(shí)由來(lái)已久，但是直到最近新一代基因測(cè)序技術(shù)的日益完善，才有可能對(duì)大量突變的新生抗原進(jìn)行識(shí)別和鑒定。通過(guò)對(duì)癌組織全外顯子基因測(cè)序，結(jié)合對(duì)人類白細(xì)胞抗原（HLA）表位結(jié)合親和力的預(yù)測(cè)，能夠?qū)γ總€(gè)患者的候選癌癥新生抗原進(jìn)行鑒定、評(píng)估和選擇。逐漸增多的證據(jù)顯示，以突變新生抗原為基礎(chǔ)的個(gè)體化癌癥疫苗具有重要的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

新生抗原總體上也可以分為兩類：共有的和獨(dú)有的。共有的新生抗原是指某些類型癌癥和不同患者間共同存在的突變抗原，而在正常基因組中并不存在。免疫原性高的共有新生抗原有可能篩選用作廣譜的治療性癌癥疫苗，用于那些有相同突變基因的患者。大多數(shù)新生抗原都是獨(dú)特的突變抗原，在患者與患者之間、腫瘤與腫瘤之間是完全不同的。因此，獨(dú)有新生抗原制備的癌癥疫苗只能特異性地、一對(duì)一地針對(duì)每個(gè)個(gè)體患者或腫瘤，從這種意義上來(lái)說(shuō)，這是真正的、純粹的個(gè)體化治療。由于相同類型腫瘤的基因突變可以有廣泛的不同，這就構(gòu)成癌癥個(gè)體化免疫治療必要性的重要基礎(chǔ)。個(gè)性化癌癥疫苗方法也是確保使每個(gè)癌癥患者產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)的最佳方法。

疫苗制備

目前，個(gè)體化新生抗原癌癥疫苗的制備過(guò)程已經(jīng)逐漸系統(tǒng)化。其基本程序主要分3個(gè)階段：收集患者的癌癥組織和正常組織標(biāo)本、新生抗原鑒定以及疫苗制備。新生抗原鑒定，首先采用全外顯子測(cè)序?qū)Ρ劝┌Y和正常組織的基因序列，獲得癌組織突變基因數(shù)據(jù)。利用突變基因編碼的新生抗原作為疫苗，要求該抗原必須具有免疫原性，換句話說(shuō)，選擇的抗原接種后要能夠引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗癌免疫反應(yīng)。因此，新生抗原鑒定還要經(jīng)過(guò)cDNA芯片或RNA序列（RNA-seq）檢測(cè)，依照基因表達(dá)水平來(lái)選擇合適的突變新生抗原。最后，采用生物信息學(xué)或人工智能算法，預(yù)測(cè)這些候選抗原與人類白細(xì)胞抗原（HLA）的黏附親和力（Banding affinity），據(jù)此進(jìn)一步將候選抗原排序并最終決定選用哪些新生抗原。

最后階段是疫苗的制備和臨床應(yīng)用。癌癥疫苗的制備有多種形式，如DNA/mRNA、合成的長(zhǎng)鏈多肽、體外抗原沖擊的樹枝狀細(xì)胞（Pulsed DCs）和生物材料輔助疫苗等。不同類型的免疫佐劑也可以增強(qiáng)疫苗的免疫原性。疫苗制備工藝和免疫佐劑都是快速發(fā)展的專業(yè)領(lǐng)域，最終目的在于能夠提高疫苗的免疫原性和療效。最后，將新生抗原疫苗有效遞送至次級(jí)淋巴器官（如淋巴結(jié)），在那里被抗原提呈細(xì)胞（APC）捕獲并呈遞給CD8+或CD4+ T細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞，最終產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

一些臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示，患者癌癥新生抗原負(fù)荷量與腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)生和患者臨床預(yù)后具有明顯相關(guān)性。研究也發(fā)現(xiàn)，如果腫瘤有較高的新生抗原，往往伴有較強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)，患者則有更好的臨床結(jié)果。一項(xiàng)對(duì)619例結(jié)直腸癌研究的資料顯示，那些有高頻率突變新生抗原的患者，往往伴有增高數(shù)量的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor Infiltration Lymphocytes，TILs），而且獲得存活率的改善。在有效的抗腫瘤免疫治療中，如使用PD-1、CTLA-4或TILs治療的患者，常常發(fā)現(xiàn)有新生抗原特異性T細(xì)胞群體的擴(kuò)增。此外，體外實(shí)驗(yàn)顯示，人和動(dòng)物的新生抗原特異性T細(xì)胞能直接殺傷表達(dá)突變抗原的腫瘤細(xì)胞，并在動(dòng)物模型中能完全抑制腫瘤生長(zhǎng)或?qū)е履[瘤縮小。

臨床應(yīng)用

有關(guān)癌癥新生抗原疫苗的臨床應(yīng)用，最近有兩項(xiàng)早期工作的報(bào)道。美國(guó)波士頓達(dá)納-法伯癌癥研究所（DFCI）使用合成的長(zhǎng)鏈新生抗原多肽，以Poly IC:LC為免疫佐劑制備疫苗治療黑色素瘤患者。每例疫苗包含多達(dá)20條預(yù)測(cè)的個(gè)體化新生抗原多肽，臨床試驗(yàn)結(jié)果證明，該疫苗使用具有可行性、安全性和免疫原性。疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生多功能CD4+和CD8+ T細(xì)胞，在患者間使用的97條獨(dú)有新生抗原中，CD4+ T細(xì)胞能識(shí)別58條（占60%）, CD8+ T細(xì)胞能識(shí)別 15條（占16%）。這些T細(xì)胞能夠?qū)ν蛔兛乖鸵吧涂乖右詤^(qū)別，并且在某些情況下能直接識(shí)別殺死自體腫瘤細(xì)胞。6名患者中，4名在接種疫苗后25個(gè)月仍未復(fù)發(fā)，而2名復(fù)發(fā)患者隨后接受PD-1藥物治療，復(fù)發(fā)腫瘤完全消退，并出現(xiàn)新生抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。這些資料為深入開發(fā)個(gè)體化疫苗技術(shù)，無(wú)論是單獨(dú)接種，還是聯(lián)合PD-1或與其他免疫療法聯(lián)合使用，提供了有力證據(jù)。

德國(guó)研究人員采用RNA為基礎(chǔ)的新生抗原疫苗治療晚期黑色素瘤。合成的mRNA 編碼多個(gè)新生抗原決定簇（poly-neoepitopes），經(jīng)淋巴結(jié)接種疫苗。免疫接種后，在所有治療的13例患者中均成功誘導(dǎo)了針對(duì)多種新生抗原的有效T細(xì)胞應(yīng)答。與達(dá)納-法伯癌癥研究所的結(jié)果類似，盡管預(yù)測(cè)選擇的多為高親和力的HLA-I型新生抗原，但大多數(shù)新生抗原誘發(fā)的是HLA-II型限制性CD4+ T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)。免疫后隨訪期，8例患者仍處于無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)狀態(tài)（接種后12～24個(gè)月）。5例復(fù)發(fā)患者中，1例病情進(jìn)展后，采用PD-1治療獲得完全緩解；1例后期復(fù)發(fā)患者對(duì)疫苗和PD-1治療均無(wú)反應(yīng)，最終死亡，復(fù)發(fā)腫瘤標(biāo)本檢查分析顯示，該患者β2微球蛋白等位基因均出現(xiàn)缺失，可能是導(dǎo)致后期對(duì)免疫治療缺乏反應(yīng)的原因；其余3例患者，均有程度不同的針對(duì)新生抗原的免疫反應(yīng)存在。這些結(jié)果也證明mRNA新生抗原個(gè)體化癌癥疫苗同樣具有重要的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

重重挑戰(zhàn)

像許多新概念剛剛出現(xiàn)一樣，學(xué)界往往存在不同的觀點(diǎn)和評(píng)價(jià)。許多學(xué)者認(rèn)為，突變新生抗原個(gè)體化癌癥疫苗是繼CAR-T和PD-1之后，腫瘤免疫治療又一個(gè)里程碑式的進(jìn)展。也有學(xué)者認(rèn)為，新生抗原是很早就有的名詞，以往包括病毒和原癌基因編碼的非突變型新生抗原，由于現(xiàn)在概念限定于隨機(jī)突變基因，使之引起越來(lái)越多的特別關(guān)注。這些學(xué)者也認(rèn)為，突變型新生抗原是否比非突變型新生抗原更具有免疫原性，還需要大量工作加以證實(shí)。雖然突變型新生抗原概念出現(xiàn)和作為個(gè)體化免疫治療新方式迅速進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但是其制作工藝屬于勞動(dòng)密集型個(gè)人定制的方式，目前可能是一種昂貴的療法。因此，在疫苗開發(fā)中沒(méi)必要去競(jìng)爭(zhēng)，或取代那些傳統(tǒng)研發(fā)的基于非突變共有新生抗原的癌癥疫苗，后者是可以廣泛適用、現(xiàn)成產(chǎn)品、具有成本效益、價(jià)格便宜的非個(gè)體化癌癥疫苗。目前，在大量突變新生抗原中篩選有明顯療效的片段仍然是難度較高的工作。此外，如何對(duì)付疫苗接種后癌細(xì)胞出現(xiàn)的新型突變導(dǎo)致的抗原逃逸，以及如何保證所有癌細(xì)胞都存在疫苗選擇的特異性突變，以避免免疫逃逸，都可能是新生抗原疫苗將要面對(duì)的挑戰(zhàn)。

從科利開始的癌癥免疫治療到現(xiàn)在已是百年變遷，CAR-T、PD-1乃至個(gè)體化突變新生抗原癌癥疫苗的出現(xiàn)，終于迎來(lái)了癌癥免疫治療的春天。考慮到CAR-T在實(shí)體腫瘤中面臨的瓶頸和PD-1藥物只在大約20%的癌癥患者中有持久療效，當(dāng)今癌癥免疫的機(jī)理許多還不十分清楚。因此，癌癥免疫治療的春天只是剛剛開始。