小麥冬春性人工低溫春化鑒定的研究

馮岳+褚蔚+隋新霞+黃承彥+崔德周+樊慶琦+楚秀生

摘要：本試驗旨在篩選適合小麥冬春性室內(nèi)鑒定的方法和指標(biāo)，以濟麥19、錢交麥、泰山1號、濟麥20、中國春為強冬性、冬性、半冬性、偏春性和春性對照，對2014—2016年山東省區(qū)試的108份小麥品種進行冬春性室內(nèi)春化鑒定、田間錯期春播鑒定和分子鑒定。通過對幼苗習(xí)性、抽穗率、抽穗期等指標(biāo)的觀察確定小麥冬春性室內(nèi)鑒定的可靠指標(biāo)，提出采用室內(nèi)鑒定法評判品種的冬春性，并初步建立了小麥品種室內(nèi)春化鑒定法檢測小麥冬春性的檢測指標(biāo)體系：春性、偏春性、半冬性、冬性和強冬性小麥品種在2℃條件下完成春化所需時間分級分別為0 d、0 d40 d。

關(guān)鍵詞：小麥；冬春性；人工低溫春化鑒定法

中圖分類號：S512.1文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）01-0009-07

Abstract To screen out the identification methods and indicators for winterness and springness of wheat indoor， we used Jimai 19， Qianjiaomai， Taishan No. 1， Jimai 20 and Chinese Spring as the control of strong winterness， winterness， semi-winterness， partial springness and springness wheat， respectively， and 108 wheat varieties from Shandong Regional Test during 2014-2016 were selected to identify the winterness and springness through indoor identification， intermission spring seeding in field， and molecular identification. Through the observation of seedling habits， heading rate and heading period， we confirmed the reliability indicators for identifying winterness and springness of wheat indoor， proposed the indoor identification method of winterness and springness of wheat varieties， and preliminary established the identification system using the artificial vernalization method to determine the winterness and springness of wheat indoor. The indentification system was as follows： under the condition of 2℃， the time for springness， partial springness， semi-winterness， winterness， strong winterness wheat varieties to complete vernalization were 0 d， 0 d40 d， respectively.

Keywords Wheat； Winterness and springness； Artificial vernalization method

小麥?zhǔn)俏覈牡诙蠹Z食作物[1]。小麥對溫光反應(yīng)的發(fā)育特性決定了其對不同區(qū)域的適應(yīng)性。春化作用特性是小麥品種的重要性狀，直接影響著小麥品種的種植范圍和利用效率。小麥品種的冬春性不同，其抗寒性、早熟性、豐產(chǎn)性往往存在較大差異，生產(chǎn)上常因忽略品種冬春性問題而造成重大損失，因此對小麥冬春性做準(zhǔn)確科學(xué)的鑒定具有重要意義。

從20世紀初蘇聯(lián)科學(xué)家Lysenko提出春化理論[2]以來，國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)等方面進行深入探討，提出過諸多冬春性鑒定方法與指標(biāo)，主要包括：形態(tài)觀察法[3，4]、田間春播法[5]、綜合順序分類法[6]、生理因子鑒定法（生長點變化、赤霉烯酮含量變化等）[7-9]、分子生物學(xué)方法（分子標(biāo)記鑒定法）[10]等。實踐中，由于鑒定目的和要求不同，所采用的鑒定方法也不同。目前應(yīng)用最廣的小麥冬春性鑒定方法為綜合順序分類法（國家標(biāo)準(zhǔn)）[11]。但該方法對田間自然條件依賴性強，而不同年份、不同區(qū)域間溫度、光照、降水等存在較大差異，使得該鑒定存在時間空間的局限性，需進行多年多地試驗才能得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，工作量大，周期長，重復(fù)性差。因此，探索一種可操作性強、限制因素少、重復(fù)性強的小麥冬春性鑒定方法和指標(biāo)成為現(xiàn)實迫切需求。本研究以2014—2015、2015—2016兩年度山東省小麥區(qū)試品種為試材進行小麥冬春性室內(nèi)鑒定，并將其結(jié)果與田間春播鑒定、分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果進行比較，旨在研究出穩(wěn)定可靠的小麥冬春性室內(nèi)鑒定指標(biāo)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為2014—2016年山東省小麥區(qū)試材料108份。強冬性、冬性、半冬性、偏春性和春性對照品種分別為濟麥19、錢交麥、泰山1號、濟麥20和中國春。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥冬春性室內(nèi)鑒定 試驗在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院春化室和智能日光溫室內(nèi)進行。每品種選飽滿籽粒140粒，70%酒精消毒處理2 min，去離子水沖洗干凈，平均分為7份，每份20粒，置于墊有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中，25℃暗培養(yǎng)箱中催芽48 h。

將催芽后的小麥籽粒分批次置于2℃低溫春化室中處理0、10、15、20、25、30、40 d（光照均為24 h/d），每隔2～3 d加水5 mL以保證培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙濕潤，水溫應(yīng)與春化室溫度相近以避免溫差太大影響小麥幼苗生長。

將分批低溫春化處理后的幼苗移栽至智能日光溫室內(nèi)的花盆中，溫室設(shè)置溫度20℃，光照為16 h/d。調(diào)查統(tǒng)計小麥品種的苗情苗相及孕穗抽穗時間。統(tǒng)計時間以70 d為限。

1.2.2 冬春性分子鑒定 利用Yan、Fu、Yoshida等[12-19]設(shè)計的STS引物，對春化基因Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B4進行分子檢測。引物序列見表1。

DNA的提?。河眯←溔~片提取基因組DNA，采用北京全式金公司生產(chǎn)的快捷型植物全基因組提取試劑盒提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品種室內(nèi)低溫春化處理鑒定結(jié)果分析

由表2、表3中5份已知標(biāo)準(zhǔn)品種可以看出：隨著春化時間的延長，冬性品種的抽穗率呈逐漸增加趨勢，且同一品種的抽穗率也隨著春化時間的增加而增加。春性品種中國春幼苗習(xí)性為半匍匐，且在春化0 d時也能正常抽穗；偏春性品種濟麥20幼苗習(xí)性為直立，春化0 d時抽穗率為35%，且麥穗較正常穗小、結(jié)實率低，春化10 d時抽穗率達到80%，可見濟麥20至少需要10 d的低溫春化時間才能正常抽穗；半冬性品種泰山1號在春化20、25、30 d和40 d處理下幼苗習(xí)性為直立，而春化0、10、15 d時均為匍匐，且春化20 d及以上處理抽穗率均為80%以上，春化0、10 d時不抽穗，春化15 d時抽穗率為30%，由此可見泰山1號至少需要20 d的低溫春化時間才能正常抽穗；冬性品種錢交麥在春化30、40 d時幼苗習(xí)性為直立，在少于30 d春化處理下幼苗習(xí)性為匍匐，春化30 d和40 d時抽穗率分別達到80%和85%，在少于30 d的春化條件下不抽穗，可以得出，錢交麥至少需要30 d的低溫春化才能正常抽穗；強冬性品種濟麥19幼苗習(xí)性僅在春化40 d時為直立，其余處理為匍匐，春化40 d的抽穗率達到90%，而春化30 d的抽穗率僅為40%，春化30 d以下處理均不抽穗，因此強冬性品種濟麥19正常抽穗至少需要低溫春化40 d。由此可以得出結(jié)論，以抽穗率80%以上視為該品種完成春化，在苗期2℃春化條件下，春性小麥品種（中國春）不需要低溫春化即可正常抽穗；偏春性小麥品種（濟麥20）完成春化至少需要10 d；半冬性小麥品種（泰山1號）完成春化至少需要20 d；冬性小麥品種（錢交麥）至少需要30 d時間完成春化；強冬性小麥（濟麥19）完成春化則需要40 d以上。依據(jù)以上規(guī)律，全部品種室內(nèi)鑒定結(jié)果見表4。

2.2 對108份小麥品種不同冬春性鑒定方法所得結(jié)果的比較

采用室內(nèi)低溫春化鑒定法、綜合順序分類法和分子標(biāo)記鑒定法對108份小麥品種進行冬春性鑒定，結(jié)果見表4。從中看出，108份供試品種中，有101份三種方法的鑒定結(jié)果相一致；7份供試材料出現(xiàn)了綜合順序分類法與室內(nèi)低溫春化法鑒定結(jié)果不符現(xiàn)象，但這7份供試材料的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果更支持室內(nèi)低溫春化法。因此，在人控低溫春化條件下進行小麥冬春性鑒定更加準(zhǔn)確可靠，且具有易掌握、可操作性強的優(yōu)點，關(guān)鍵是可以準(zhǔn)確確定待測小麥品種正常抽穗開花所需的臨界低溫春化時間（最短春化時間）。

2.3 對7份品種冬春性鑒定結(jié)果存在差異的原因分析

針對泰麥1918、11WST045、菏麥0605、鑫麥803、博農(nóng)麥8號、煙農(nóng)194、岱麥3166共7份品種綜合順序分類法與室內(nèi)低溫春化法鑒定結(jié)果不相符的原因進行分析，可以看出，鑒定結(jié)果的差異與田間鑒定法依賴田間自然低溫春化有關(guān)。綜合順序分類法鑒定小麥品種的冬春性需在平均溫度達到3℃、7℃和10℃的條件下進行分期播種，以7℃及30%抽穗率作為劃分冬性和春性的標(biāo)準(zhǔn)，以3℃及0、5%和20%抽穗率作為劃分強冬性、冬性和半冬性的標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的確立地點是河南省，該省大部分屬于溫帶季風(fēng)氣候，南部小部分屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，春季回溫緩和；而濟南市氣候特點為春季氣溫回升快，日差較大。根據(jù)濟南地區(qū)的氣候條件，平均氣溫達到3℃、7℃和10℃通常在2月27日、3月6日和3月13日，但不同年份之間存在不同程度的差異。如圖1所示，4年里濟南地區(qū)2月27日—3月6日和3月6日—3月13日的積溫， 2012年3月6日—3月13日積溫明顯低于正常年份的65℃，其積溫更接近常年2月27日—3月6日之間的積溫（氣溫信息來自中國氣象網(wǎng)），這可能是泰麥1918、11WST045鑒定出現(xiàn)誤差的原因。2013年2月27日—3月6日的積溫均明顯高于其它年份，高溫可能通過降低待測小麥的春化程度進而影響到待測小麥的鑒定結(jié)果，使得菏麥0605、鑫麥803鑒定出現(xiàn)誤差。如圖2所示，雖然2015年積溫條件正常，但2015年3月濟南氣溫變化波動明顯，其中3月8日—3月10日出現(xiàn)了較強降溫，較大的溫差可能是博農(nóng)麥8號、煙農(nóng)194、岱麥3166鑒定誤差的原因。由此可以看出，由于不同地區(qū)、不同年份間氣候的差異，使得依賴自然低溫條件春化的綜合順序分類法出現(xiàn)了不同程度的誤差，因此為得到更加準(zhǔn)確可靠的鑒定結(jié)果，需要進行多年多地的鑒定。

2.4 小麥冬春性人工低溫春化鑒定體系

從本研究結(jié)果看，單株抽穗率大于80%視為正常抽穗，正常抽穗所需最低春化時間視為該品種抽穗的臨界春化時間，則偏春性、半冬性、冬性和強冬性小麥品種的臨界春化時間可分別確定為0 d40 d。

3 討論與結(jié)論

本試驗用人工低溫春化法、綜合順序分類法和分子標(biāo)記鑒定法，對2014—2016年的108份山東省區(qū)域試驗品種進行了冬春性鑒定，3種方法的鑒定結(jié)果基本相符，但仍存在一些鑒定方面的誤差，這些誤差，也從不同層面、不同程度反映出不同冬春性鑒定方法的優(yōu)勢及存在的不足。

3.1 綜合順序分類法

綜合順序分類法，是2009年張燦軍[6]提出的一種冬春性鑒定方法，目前應(yīng)用最廣。該方法是通過調(diào)節(jié)播種時間、利用春季氣溫回升過程中自然條件的低溫變化，對待測小麥品種進行不同程度的低溫春化處理，從而達到對待測小麥品種的春化習(xí)性進行分級分類的目的。該方法的優(yōu)點是適應(yīng)范圍廣：我國小麥種植區(qū)域氣候類型多為溫帶大陸性氣候、溫帶季風(fēng)氣候，該氣候具有四季分明、氣候溫和的特點，這就決定了通過分期播種，利用自然條件下春季回溫緩慢的特點可以有效地鑒定小麥品種的春化特性。該方法也有如下局限性。第一，春化過程中溫度控制的局限性：正常年份下，氣溫較往年變化波動小，綜合順序分類法可以完成小麥冬春性的鑒定；但極端天氣（倒春寒）或者溫度變化波動較大（暖冬）的天氣條件，會對鑒定結(jié)果有很大影響。例如2013年濟南地區(qū)氣溫回升快、春季積溫明顯高于往年，2015年3月3日和3月9日出現(xiàn)了大幅度的降溫，這就可能使得依靠自然氣溫回升的冬春性鑒定出現(xiàn)誤差。第二，鑒定時間的局限性：該方法依靠自然低溫完成小麥的春化過程，這就要求其鑒定過程對季節(jié)和時間有嚴格的要求，每年只能完成1次鑒定。第三，沒有考慮到光周期對抽穗率的影響：綜合順序分類法因自然條件的限制，無法對春化過程中光周期的條件進行調(diào)控。因此，該方法需要進行多年多地試驗才能得到更加準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

3.2 分子標(biāo)記鑒定

截止目前的研究，已知的4份與小麥春化反應(yīng)有關(guān)的基因中，主效基因Vrn-1位于小麥的A、B和D染色體組的第5染色體長臂上，分別命名為Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1[12-17，20]。小麥春化基因的顯隱性受春化基因的2份位點控制，即基因啟動子（promoter）和第一份內(nèi)含子（intron）部位。Yan和Fu等[12-17]根據(jù)顯性與隱性等位基因在Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1位點序列差異，設(shè)計了特異性引物，能有效地對Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1和Vrn-B4的不同變異類型和顯隱性進行辨別和區(qū)分。利用分子標(biāo)記鑒定方法，能有效地鑒定待測品種的春化基因型，不受時間空間的限制且準(zhǔn)確性高。但根據(jù)對小麥春化現(xiàn)象的研究，春性性狀相對于冬性性狀為顯性，春性小麥品種至少含有一份以上的VRN1基因，而冬性小麥品種其VRN1春化基因型均為隱性純合；但冬性小麥卻與其基因型的純合性不同，小麥冬性性狀存在著偏春性、半冬性、冬性和強冬性等不同的性狀類型。小麥冬春性基因型和表現(xiàn)型的特殊性意味著僅依靠分子標(biāo)記鑒定法只能對小麥品種的冬性和春性進行有效鑒定，很難就冬性性狀的強弱進行有效區(qū)分。

3.3 人工低溫春化鑒定

通過兩年的系統(tǒng)研究，初步建立了人工低溫春化鑒定的指標(biāo)體系。人工低溫春化鑒定方法，通過對低溫春化溫度、時間及后期生長過程中溫度、光照時間的控制，通過抽穗率指標(biāo)對小麥冬春性類型進行劃分，能有效地對不同小麥品種通過春化所需的低溫時間進行劃分，排除了自然低溫春化過程中溫度變化的影響以及后期生長過程中低溫再春化和特殊天氣對鑒定結(jié)果造成的影響，具有準(zhǔn)確度高、針對性強的特點。利用人工低溫春化法進行鑒定由于所有的鑒定過程均在室內(nèi)完成，能夠?qū)崿F(xiàn)一年多次鑒定且鑒定速度較快。但該鑒定法需要人工低溫春化室和人工智能氣候溫室等，鑒定成本較高。

綜上所述，小麥冬春性鑒定工作應(yīng)根據(jù)不同條件不同要求采取不同的鑒定方法或者采用多種鑒定法相結(jié)合以得到更為準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

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