犬瘟熱疫苗研究進(jìn)展

摘 要：犬瘟熱（CD）是由犬瘟熱病毒（CDV）感染犬和其他食肉動(dòng)物引起的一種病死率高的接觸性傳染病。近年來(lái)暴發(fā)了多起犬和野生動(dòng)物自然感染犬瘟熱病毒的案例。目前尚無(wú)治療犬瘟熱的有效藥物或生物制劑。犬瘟熱的預(yù)防主要依靠接種疫苗，應(yīng)用最為廣泛的是弱毒活疫苗，但也存在一些問(wèn)題。論文主要概述了犬瘟熱弱毒活疫苗、基因疫苗、病毒載體疫苗的研究進(jìn)展，以期為研制安全、高效的犬瘟熱新疫苗提供參考。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007－5038（2015）10－0085－05

收稿日期：2015－03－25

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃基金項(xiàng)目（20140307002NY）

作者簡(jiǎn)介：薛向紅（1985－），女，山西呂梁人，助理研究員，博士，主要從事毛皮動(dòng)物傳染病病原與疫苗研究。＊通訊作者

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）侵害犬等食肉動(dòng)物引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，臨床癥狀多樣性，感染動(dòng)物后期免疫力驟降，容易繼發(fā)混合感染和二次感染，致死率高。犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬成員，是單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒。其基因組大小為15 690bp，從3′到5′端依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大轉(zhuǎn)錄蛋白（L）。其中，H蛋白介導(dǎo)CDV與宿主細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合，使病毒黏附到宿主細(xì)胞表面；F蛋白介導(dǎo)病毒與感染細(xì)胞、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞的融合，使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并得以散播。H和F蛋白是刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的重要抗原。

近20年來(lái)，隨著人類(lèi)對(duì)野生動(dòng)植物資源的開(kāi)發(fā)利用，野生動(dòng)物棲息環(huán)境發(fā)生了改變，加上病毒自身的不斷演化，CDV的自然宿主從最初的犬科動(dòng)物（Canidae）不斷擴(kuò)大至貓科（Felidae）、鬣狗科（Hyaenidae）、鼬科（Mustelidae）、浣熊科（Procyonidae）、熊科（Ursidae）、靈貓科（Viverridae）、熊貓科（Ailuridae）和臭鼬科（Mephitidae）動(dòng)物 ［1］。CD的流行對(duì)犬、毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物、野生動(dòng)物的生命安全造成了嚴(yán)重威脅，給養(yǎng)殖戶(hù)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。野生動(dòng)物老虎、獅子、豹和海豹等，甚至一些珍稀物種如大熊貓、小熊貓等都暴發(fā)過(guò)犬瘟熱。2015年1月陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)研究中心圈養(yǎng)的大熊貓感染CDV強(qiáng)毒株，死亡4只。實(shí)際上，已經(jīng)有CDV自然感染非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如我國(guó)的獼猴和日本的食蟹猴的報(bào)道 ［2－3］。人的變形性骨炎（Paget＇s）患者體內(nèi)檢測(cè)到了CDV的核酸 ［4］，這提示犬瘟熱有可能成為人獸共患傳染病，因而該病引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。本文就CD疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期為研制安全、高效的CD疫苗提供參考。

1 傳統(tǒng)疫苗

1．1 滅活疫苗

Puntoni最先利用福爾馬林滅活感染CDV的犬腦組織，制備了組織滅活苗，接種犬后，當(dāng)其體內(nèi)中和抗體滴度小于1∶20時(shí)，能產(chǎn)生較弱的抵抗強(qiáng)毒攻擊的免疫反應(yīng)，但此類(lèi)疫苗無(wú)法有效地控制犬瘟熱。夏咸柱等用靜水壓高壓方法滅活CDV后，以蜂膠為佐劑制備的CD滅活疫苗，誘導(dǎo)犬產(chǎn)生中和抗體的能力明顯高于福爾馬林滅活苗，臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該疫苗對(duì)犬的保護(hù)率達(dá)89% ［5］。犬瘟熱蜂膠組織滅活苗能使水貂產(chǎn)生與弱毒苗同等效力的免疫反應(yīng)，免疫后8個(gè)月內(nèi)對(duì)水貂具有100%保護(hù)，可用于緊急接種，預(yù)防水貂犬瘟熱暴發(fā)。由于CD滅活苗激發(fā)產(chǎn)生的抗體水平下降快，僅誘導(dǎo)體液免疫，抗體持續(xù)時(shí)間短，疫苗免疫原性差等缺點(diǎn)，現(xiàn)已很少使用。

1．2 弱毒活疫苗

弱毒活疫苗（modified live vaccine，MLV）株是將自然分離的犬源、貂源CDV經(jīng)雞胚、細(xì)胞多次傳代適應(yīng)而致弱，它們對(duì)犬有較高的安全性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)免疫記憶，具有良好的免疫原性。好的弱毒活疫苗既要對(duì)易感動(dòng)物具有較高的安全性，又要具有良好的免疫原性，可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗體反應(yīng)和細(xì)胞應(yīng)答。19世紀(jì)50至60年代，CD弱毒活疫苗研制成功，它的廣泛應(yīng)用極大地降低了犬群中CD的發(fā)病和流行。犬用商業(yè)疫苗幾乎都是多聯(lián)疫苗，除CDV外，還包含犬細(xì)小病毒、滅活的狂犬病病毒、犬肝炎病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒或犬鉤端螺旋體等。犬用CDV標(biāo)準(zhǔn)弱毒疫苗株主要有Onderseport、Lederle、Convac和犬腎細(xì)胞適應(yīng)株Rockborn。自1977年以來(lái)，我國(guó)先后從國(guó)外引進(jìn)的CD弱毒疫苗中分離獲得美國(guó)株、法國(guó)株和前蘇聯(lián)株等犬瘟熱弱毒疫苗株，其中CDV／R－20／8株是國(guó)產(chǎn)犬用五聯(lián)弱毒疫苗或六聯(lián)弱毒疫苗所用的犬瘟熱病毒株。其他毛皮動(dòng)物的犬瘟熱弱毒疫苗主要是單苗，市售的水貂用犬瘟熱毒株為CDV3和CDV－11株。將這些弱毒活疫苗制成凍干苗和濕苗，應(yīng)用于犬或其他易感動(dòng)物，取得了很好的免疫效果，有效控制了犬群中犬瘟熱的暴發(fā)和流行。為了提高CD MLV的免疫效果，有學(xué)者以合成的陽(yáng)離子脂肽Pam3CSK4和PHCSK4為佐劑，經(jīng)雪貂體內(nèi)試驗(yàn)，表明其能夠增強(qiáng)麻疹病毒（Mealse virus，MeV）和CD弱毒活疫苗的免疫效果 ［6］。CD弱毒活疫苗接種犬時(shí)，肌肉和靜脈注射效果要優(yōu)于皮下注射效果，除非緊急接種，一般不提倡靜脈途徑 ［7］。為避免新生犬中CDV母源抗體的干擾，幼犬?dāng)嗄毯?周～3周進(jìn)行接種犬瘟熱弱毒活疫苗，這個(gè)時(shí)候母源抗體基本消退，不會(huì)影響免疫效果。

雖然犬瘟熱弱毒活疫苗的使用曾經(jīng)大大減少了CDV對(duì)大批犬的感染，但是它們對(duì)野生動(dòng)物不同程度地致病性值得人們深思。目前，犬和野生動(dòng)物中暴發(fā)CD的案例逐年增多，有研究表明，國(guó)內(nèi)流行犬瘟熱野毒株與商業(yè)疫苗毒株的抗原蛋白存在較大差異 ［8］。因此，需要考慮現(xiàn)行使用的犬瘟熱弱毒疫苗是否能夠預(yù)防不斷變異、自然宿主不斷擴(kuò)大的犬瘟熱病毒感染，研制既有高安全性又有良好免疫原性的MLV具有重要的實(shí)際意義。

2 基因疫苗

基因疫苗（DNA疫苗）的顯著特點(diǎn)在于其不含病原成分，安全、純度高。Sixt N等最早構(gòu)建的CDV H、F的重組DNA，混合或單獨(dú)在小鼠體內(nèi)均能誘導(dǎo)高水平中和抗體。試驗(yàn)表明，CDV弱毒株的H基因疫苗在水貂體內(nèi)也能激發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，而且攻毒后，抗病毒因子IFN－γ的含量迅速增加 ［9］。這都輔助證明，CDV H和F蛋白是重要的保護(hù)性抗原。強(qiáng)毒A75／17株的N、F和H基因重組質(zhì)粒接種小鼠，證明DNA疫苗能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)；比格犬體內(nèi)試驗(yàn)表明，免疫犬攻毒后，雖能在體內(nèi)檢測(cè)到病毒增殖，但最后得以存活。首次證明CD DNA疫苗能保護(hù)CDV敏感動(dòng)物犬抵抗強(qiáng)毒攻擊 ［10］，推測(cè)其保護(hù)依據(jù)是，攻毒時(shí)，強(qiáng)烈刺激了免疫犬體內(nèi)的免疫記憶細(xì)胞，在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量特異性中和抗體，其他DNA疫苗免疫研究也證明了這一點(diǎn) ［9－11］。因此，無(wú)論CDV強(qiáng)毒株還是弱毒株，其囊膜蛋白基因疫苗都可以在易感動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)體液反應(yīng)，攻毒后刺激免疫記憶細(xì)胞迅速活化，分泌大量IFN－γ，發(fā)揮抗病毒效應(yīng) ［11］。經(jīng)皮內(nèi)或肌肉途徑給水貂注射CD DNA疫苗，水貂都產(chǎn)生了特異性中和抗體，抵抗了強(qiáng)毒攻擊 ［12－13］。經(jīng)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化后的CDV F、H、M、N基因的重組DNA混合接種犬，發(fā)現(xiàn)含CDV－N組的抗體滴度比不含CDV－N組的加強(qiáng)免疫后顯著升高，峰值可達(dá)到26．54，很可能是N蛋白上的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位刺激機(jī)體產(chǎn)生了免疫記憶細(xì)胞的緣故；初免后第54周犬體內(nèi)CDV抗體維持在2 6［14］，可見(jiàn)密碼子優(yōu)化后的抗原基因免疫效果良好。聚乙烯胺（PEI）同CDV中國(guó)分離株YZ0101的H、F和N的重組質(zhì)粒聯(lián)合免疫比格犬，三免后抗體滴度為101．75±0．190，未達(dá)到臨界保護(hù)線10 2。但攻毒后，免疫組經(jīng)過(guò)一過(guò)性體溫升高，第18天外周血淋巴細(xì)胞CDV檢測(cè)為陰性，之后免疫犬存活。而且，PEI佐劑組比裸DNA組的免疫效果稍好，可見(jiàn)，PEI協(xié)同或增強(qiáng)了細(xì)胞免疫。其他病毒DNA免疫研究中也有類(lèi)似報(bào)道，攻毒前免疫動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度未達(dá)到保護(hù)線，但仍能抵抗相應(yīng)的強(qiáng)毒攻擊。因此，DNA免疫中細(xì)胞免疫和抗體記憶效應(yīng)對(duì)免疫保護(hù)非常重要 ［15］。大熊貓?jiān)碐M－CSF的重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)增強(qiáng)了CDV N基因疫苗的免疫效果，外周血中IL－4和IFN－γ含量增加 ［16］。犬瘟熱DNA疫苗另一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì)在于，能夠克服幼齡動(dòng)物體內(nèi)母源抗體的干擾，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)。幼齡水貂體內(nèi)研究表明，存在母源抗體時(shí)，DNA疫苗能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，CDV H基因疫苗比H、F和N基因疫苗混合免疫的保護(hù)效果好 ［17］。但是，限制DNA疫苗應(yīng)用的重要原因是其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平比較低。

3 亞單位疫苗

國(guó)內(nèi)外研究者構(gòu)建了CDV主要抗原蛋白的原核／真核表達(dá)系統(tǒng)，但CDV亞單位疫苗實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道很少。徐向明等在大腸埃希菌中高效表達(dá)CDV囊膜蛋白H、F，回收后免疫小鼠，獲得的抗血清能與感染CDV的細(xì)胞特異地結(jié)合，混合免疫后能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生1∶16的中和抗體，驗(yàn)證了囊膜蛋白是保護(hù)性抗原，具有良好的免疫原性 ［18］。王亞君等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)CDV F蛋白上重要的輔助性T、B細(xì)胞抗原表位（T＇TB）和犬細(xì)小病毒VP2蛋白，免疫小鼠產(chǎn)生了抗CDV和CPV的特異性抗體，這為同時(shí)預(yù)防犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病的新型亞單位疫苗的研制奠定了重要基礎(chǔ) ［19］。

4 病毒載體疫苗

病毒作為疫苗載體，分為復(fù)制型和復(fù)制缺陷型，復(fù)制型病毒載體疫苗能引起強(qiáng)烈和持久的免疫反應(yīng)，但是該疫苗不適合免疫力低下的個(gè)體使用。復(fù)制缺陷型載體相對(duì)安全些，需要大劑量才能達(dá)到最佳的免疫效果。

4．1 痘病毒載體疫苗

犬接種MeV疫苗后，雖然體內(nèi)檢測(cè)不到抗CDV抗體，但能抵抗CDV感染。近期在食蟹猴的試驗(yàn)表明，給接種MeV疫苗的食蟹猴攻CDV強(qiáng)毒后，能夠獲得部分保護(hù)，體內(nèi)抗MeV特異性抗體水平迅速升高，白細(xì)胞明顯增多 ［20］?？梢?jiàn)，同種屬的MeV和CDV間具有交叉保護(hù)作用。表達(dá)MeV N、M和F蛋白的重組痘苗病毒免疫小鼠受到CDV攻擊時(shí)，部分獲得保護(hù)；只表達(dá)F蛋白時(shí)，保護(hù)率為100% ［21］。犬接種表達(dá)MeV H或／和F蛋白的重組痘病毒后，攻擊CDV強(qiáng)毒，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)接種了表達(dá)MeV F的重組痘病毒的犬出現(xiàn)了一過(guò)性犬瘟熱癥狀，但最后得以存活 ［22］。金絲雀痘病毒在犬體內(nèi)無(wú)法復(fù)制，犬接種表達(dá)MeV H和F蛋白的重組金絲雀痘病毒后能抵抗CDV致死性攻擊 ［23］。因此，無(wú)論以復(fù)制型還是復(fù)制缺陷型病毒為載體表達(dá)MeV保護(hù)性抗原的重組病毒都能夠抵抗同種屬的CDV強(qiáng)毒攻擊，這也證明了MeV和CDV的主要保護(hù)性抗原間具有交叉免疫保護(hù)作用。減毒牛痘病毒NYVAC或金絲雀痘病毒ALVAC在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不能高效復(fù)制，幼年雪貂接種以它們?yōu)檩d體表達(dá)CDV H和F蛋白的重組病毒后，產(chǎn)生了高水平中和抗體（≥1∶96），攻毒后沒(méi)有出現(xiàn)犬瘟熱癥狀，而弱毒苗組則呈現(xiàn)一過(guò)性體重下降。其他類(lèi)似研究證明，重組金絲雀痘病毒疫苗對(duì)大熊貓 ［24］、西伯利亞艾鼬、狐獴 ［25］及雪貂等CDV易感物種都是安全的。而且，與CDV弱毒活疫苗相比，復(fù)制缺陷的重組金絲雀痘病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)更為溫和，適用于存在母源抗體的幼齡動(dòng)物 ［26］。在美國(guó)，重組金絲雀痘苗病毒CDV疫苗現(xiàn)已投入實(shí)際應(yīng)用。

4．2 腺病毒載體疫苗

目前尚無(wú)可以有效克服幼齡動(dòng)物母源抗體干擾的CDV疫苗。重組CDV H、F的復(fù)制完全型腺病毒CAV－2經(jīng)犬鼻內(nèi)黏膜免疫，能激發(fā)CDV抗體陰性且CAV－2抗體陽(yáng)性的犬產(chǎn)生體液免疫并達(dá)到保護(hù)水平。但是，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)處于CDV母源抗體陽(yáng)性和CAV抗體陽(yáng)性時(shí)，該免疫途徑無(wú)法激發(fā)有效的特異性免疫應(yīng)答。改為皮下接種時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生了抗CDV特異性免疫應(yīng)答 ［27］。葛艷華等 ［28］成功構(gòu)建了表達(dá)Asia－1型CDV分離株HLJ2－07H蛋白的重組犬腺病毒2型載體。鞠會(huì)艷等完成了CDV N基因重組腺病毒的構(gòu)建、鑒定與表達(dá) ，并構(gòu)建了表達(dá)CDV H的重組腺病毒 ［29］。與DNA疫苗相比，重組CDV腺病毒可以經(jīng)口服和肌肉等多種途徑免疫，尤其是對(duì)于兇猛的野生動(dòng)物。犬免疫試驗(yàn)表明，重組CDV腺病毒聯(lián)合DNA疫苗的免疫效果優(yōu)于各自單獨(dú)免疫，但都不如CDV弱毒苗的效果 ［30］。王勝樂(lè)等 ［31］構(gòu)建了犬瘟熱重組腺病毒疫苗CAV－CDV－H 和CAV－CDV－F，在水貂上的試驗(yàn)結(jié)果顯示，CAVCDV－H組的免疫效果最好，存活率為100%；其次是等劑量CAV－CDV－H和CAV－CDV－F免疫組的；CAV－CDV－F組的免疫效果最差。這也證明CDV H蛋白是主要保護(hù)性抗原，而F蛋白也能刺激機(jī)體產(chǎn)生一定水平的抗體。

4．3 其他病毒載體疫苗

隨著體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)的發(fā)展，反向遺傳學(xué)技術(shù)為新型犬瘟熱疫苗的研發(fā)提供了強(qiáng)有力的工具。利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將eGFP基因插入CDV L基因中能夠使病毒致弱，重組病毒有潛力成為弱毒活疫苗候選株 ［32］。刪除H蛋白N端的所有糖基化位點(diǎn)可以致弱CDV野生毒株 ［33］。表達(dá)CDV野毒株H蛋白的重組MeV，接種雪貂后不引起任何臨床癥狀或免疫抑制，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗CDV抗體，且能夠抵抗CDV強(qiáng)毒攻擊 ［34］。這表明MeV和CDV存在交叉保護(hù)。表達(dá)CDV H和F蛋白的重組新城疫病毒rLa－CDV－F和rLa－CDV－H在小鼠和犬體內(nèi)都能誘發(fā)保護(hù)性中和抗體，但單獨(dú)rLa－CDV－H的免疫效果優(yōu)于單獨(dú)rLa－CDV－F的和兩種聯(lián)合免疫的。這表明H蛋白是重要的保護(hù)性抗原 ［35－36］。表達(dá)狂犬病病毒（RV）糖蛋白G的rCDV－RVG對(duì)小鼠和犬都是安全的，在犬體內(nèi)能同時(shí)持久地激發(fā)高水平抗RV和抗CDV抗體 ［37］，有希望用作犬二聯(lián)苗。同樣地，表達(dá)CDV H蛋白的重組狂犬病病毒LBNSE－CDVH株對(duì)犬具有安全性，并能激發(fā)抗RV和抗CDV中和抗體，有潛力用于研發(fā)野生動(dòng)物二聯(lián)疫苗 ［38］。CDV具有免疫細(xì)胞趨向性，因此研究人員將其作為載體表達(dá)SIV囊膜蛋白，CDV－SIV經(jīng)鼻內(nèi)免疫雪貂，能夠安全誘導(dǎo)雪貂產(chǎn)生抗SIV囊膜蛋白的ELISA抗體以及抗CDV中和抗體 ［39］。王磊等 ［40］利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了雙H蛋白的重組犬瘟熱病毒，在犬體內(nèi)激發(fā)的中和抗體滴度比親本毒株的高出2倍～3倍。為了增強(qiáng)CD疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答和其抗病毒作用，劉玉秀等構(gòu)建了表達(dá)鼠源／犬源IL－18的重組CDV，兩株重組病毒都能在細(xì)胞水平表達(dá)成熟型IL－18，并能刺激犬或鼠免疫細(xì)胞分泌IFN－γ ［8］。

5 小結(jié)

隨著CDV不斷變異，自然感染宿主不斷擴(kuò)大，對(duì)犬、野生動(dòng)物和毛皮動(dòng)物的生命安全帶來(lái)了巨大威脅。弱毒活疫苗雖然極大地降低了犬群中犬瘟熱的發(fā)病和流行，但它對(duì)野生物種致病的風(fēng)險(xiǎn)值得重視。核酸疫苗克服了母源抗體的干擾具有一定的保護(hù)效果，但激發(fā)的抗體水平比較低。核酸疫苗配合弱毒活疫苗的免疫研究比較多。犬瘟熱病毒的流行毒株同商業(yè)疫苗株主要抗原蛋白的分子差異較大。基于人們對(duì)CDV基因組結(jié)構(gòu)、感染和復(fù)制機(jī)制及其疫苗的深入研究，基因工程疫苗是目前研究的熱點(diǎn)，效果良好。因此，充分利用基因工程技術(shù)，研制安全、高效、成本低廉的犬瘟熱疫苗或其他新型病毒免疫制劑對(duì)預(yù)防、控制國(guó)內(nèi)犬瘟熱疫情蔓延具有重要實(shí)際意義。