泰州地區(qū)雞沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性調(diào)查

顏衛(wèi)+安楠+魏雨瓊+周宇婷

摘要 沙門氏菌可引起雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒等沙門氏菌病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)產(chǎn)生了巨大威脅。動(dòng)物養(yǎng)殖中抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了沙門氏菌耐藥性的出現(xiàn)，這給沙門氏菌病的防治增加了難度。本研究從泰州地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集病死雞病料、健康家禽的泄殖腔樣本進(jìn)行沙門氏菌株的分離鑒定，通過(guò)藥敏試驗(yàn)了解耐藥狀況。結(jié)果表明，共分離樣品339份，活禽檢出率為2.3%，病料檢出率為8.5%。

關(guān)鍵詞 雞；沙門氏菌；耐藥性；檢出率；江蘇泰州

中圖分類號(hào) S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）01-0225-01

Isolation，Identification and Drug Resistance of Chicken Salmonella in Taizhou Area

YAN Wei AN Nan WEI Yu-qiong ZHOU Yu-ting

（Jiangsu Agricultural and Animal Husbandry Science and Technology Vocational College，Taizhou Jiangsu 225300）

Abstract Salmonella can cause salmonellosis such as white diarrhea，fowl typhoid and paratyphoid，which cause a great threat to China′s chicken industry.The widespread use of antibiotics in animal husbandry has led to the emergence of salmonella resistance，which has made it more difficult to control salmonella.In this study，chickens were collected from farms in Taizhou，and the cloacal samples from healthy poultry were isolated and identified.Salmonella isolates were identified by drug susceptibility test.The results showed that a total of 339 samples were isolated，the detection rate of live poultry was 2.3% and the detection rate of the disease was 8.5%.

Key words chicken；salmonella；drug resistance；detection rate；Taizhou Jiangsu

雞源沙門氏菌病主要引起雞的敗血癥，會(huì)通過(guò)種蛋垂直傳播，導(dǎo)致蛋品質(zhì)下降、雛雞先天帶菌等，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害?，F(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中抗生素藥物的濫用問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，增加了雞源沙門氏菌病的防治難度，加大了生產(chǎn)成本，也威脅到人體健康和公共衛(wèi)生安全[1-3]。本文對(duì)泰州地區(qū)雞沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定和耐藥性調(diào)查，以期為養(yǎng)雞業(yè)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑耗材

SS瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定管和標(biāo)準(zhǔn)藥敏片購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司，PCR儀、離心機(jī)購(gòu)于Eppendorf公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Bio-Rad公司。

1.2 樣品來(lái)源

2016年11月至2017年7月，在泰州地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)無(wú)菌采集病死雞的肝臟、脾臟等病料82份，以棉簽采集健康雞泄殖腔拭子257份進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè)。

1.3 沙門氏菌的分離

用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)肝、脾組織，接種環(huán)挑取切面平板劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，泄殖腔拭子直接劃線接種于SS瓊脂培養(yǎng)基[1-2，4-5]，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，將透明或帶有黑點(diǎn)的疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.4 沙門氏菌的鑒定

1.4.1 革蘭氏染色鑒定。挑取SS瓊脂培養(yǎng)基純培養(yǎng)的菌落進(jìn)行革蘭氏染色。在載玻片上滴1滴生理鹽水，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落涂片[1，6]，酒精燈固定，草酸銨結(jié)晶紫溶液染60 s，斜置流水緩慢沖洗，碘液染色1 min，斜置流水緩慢沖洗，乙醇脫色30 s，斜置流水緩慢沖洗，沙黃溶液染1 min，斜置流水緩慢沖洗，輕甩載玻片上多余水分，晾干，油鏡觀察[7]。

1.4.2 生化鑒定。用葡糖糖、麥芽糖、乳糖、庶糖、鼠李糖、甘露醇、果糖進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，再進(jìn)行尿素酶、吲哚、硫化氨、MR、VP試驗(yàn)[1，5]。37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.4.3 PCR鑒定。采取煮沸法制備菌株DNA模板每株菌桃取3～5個(gè)純化的單菌落，用150 μL PBS制成懸菌液，100 ℃煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心1 min，取上清液作為DNA模板[6]。

擴(kuò)增沙門氏菌的保守基因invA，擴(kuò)增體系為25 μL，其中ddH2O 17.5 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、Taq酶2 μL、10 μmoL引物1 μL、DNA模板1 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)成像觀察，目的擴(kuò)增片段為373 bp。

1.5 沙門氏菌的耐藥性

選用臨床常用的13種藥物，分別為氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、復(fù)方新諾明、磺胺，參照2010年美國(guó)CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)沙門氏菌分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)[1]。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌分離鑒定結(jié)果

由表1可知，82份死亡雞病料檢出陽(yáng)性樣品7份，檢出率8.5%；257份健康雞泄殖腔拭子檢出陽(yáng)性樣品6份，陽(yáng)性率2.3%。

2.2 耐藥率

13株沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，分離菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢他啶、氨曲南、阿米卡星、環(huán)丙沙星敏感：對(duì)其他藥物均有耐藥性，尤其對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺、鏈霉素、萘啶酸具有耐藥性，耐藥率分別為38.5%、46.2%、46.2%、53.8%、69.2%。

3 結(jié)論與討論

健康雞泄殖腔拭子沙門氏菌檢出率較低（2.3%），肝臟呈土黃色，部分有灰白色壞死灶，心臟上有結(jié)節(jié)的病雞沙門氏菌檢出率較高。本次試驗(yàn)共分離樣品339份，活禽檢出率為2.3%，與薛俊龍等[7]的研究相似，病料檢出率為8.5%，可能是由于病料采集前養(yǎng)殖場(chǎng)已使用藥物進(jìn)行治療。

為了降低沙門氏菌的耐藥性，必須嚴(yán)禁抗生素的濫用，治療沙門氏菌病時(shí)，最好先進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，篩選出高敏藥物后再進(jìn)行治療。

硫酸鏈霉素作為氨基糖苷類的早期藥物，臨床用藥已數(shù)十年，已經(jīng)產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，臨床上治療雞沙門氏菌病時(shí)應(yīng)避免使用硫酸鏈霉素[1]。萘啶酸為第1代喹諾酮類抗菌藥，本試驗(yàn)有9株對(duì)萘啶酸耐藥。慶大霉素同為氨基糖甙類廣譜抗生素，對(duì)多種革蘭陰性菌及陽(yáng)性菌都具有抑菌和殺菌作用，但腎毒性較強(qiáng)，不推薦使用。環(huán)丙沙星為合成的第3代喹諾酮類抗菌藥物，具廣譜抗菌活性，殺菌效果好。頭孢曲松為第3代頭孢菌素類抗生素，頭孢他啶為一種單酰胺環(huán)類的新型β-內(nèi)酰胺抗生素。本次分離的沙門氏菌有6株對(duì)氨芐西林耐藥[1，6]，說(shuō)明該藥不適合于臨床防治沙門氏菌。氨曲南雖然抗菌活性較好，但具有腎毒性、免疫原性弱以及青霉素類、頭孢菌素類交叉過(guò)敏少等特點(diǎn)[1-2]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 王菊梅.新疆部分地區(qū)雞源沙門氏菌分離鑒定與防治技術(shù)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[2] 方翟.湖北省雞源沙門氏菌的分離鑒定和耐藥性分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[3] 王菊梅，李雨軒，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，等.禽源沙門氏菌的分離與鑒定[J].新疆畜牧業(yè)，2015（1）：33-34.

[4] 宋健，龔子桓，王蒙蒙，等.雞白痢沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（16）：110-112.

[5] 孫和梅.延慶縣柴雞幾白痢沙門氏菌病的調(diào)查及綜合防治[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009.

[6] 楊曉林，陳英，余松城，等.1株鴿源雞桿菌復(fù)合群3的分離和鑒定[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2014，40（3）：249-256.

[7] 薛俊龍，田林君，張國(guó)權(quán)，等.山西省雞沙門氏菌病流行病學(xué)調(diào)查分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué).2010，38（9）：58-62.endprint