飼料中添加中性蛋白酶對吉富羅非魚生長和消化功能的影響

趙覓美+齊遵利+張秀文

摘 要：在吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）基礎飼料中添加中性蛋白酶，添加量分別為0.00%、0.05%、01%、0.15%、0.2%和0.25%，研究添加后對吉富羅非魚生長和消化功能的影響。結果表明，在飼料中添加0.1%～0.25%的中性蛋白酶，吉富羅非魚的相對增重率和特定生長率顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低（P<005）；添加0.1%～0.2%的中性蛋白酶，顯著提高飼料干物質(zhì)表觀消化率和粗蛋白表觀消化率（P<005）；添加量為0.1%～0.15%時，肝胰臟蛋白酶顯著高于對照組（P<0.05），添加量為0.15%時，腸道蛋白酶活性顯著提高（P<0.05）。綜合魚體相對增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、消化器官消化酶活性等各項指標，吉富羅非魚飼料中中性蛋白酶的添加量以飼料的0.1%～0.2%為宜。

關鍵詞：吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）；中性蛋白酶；生長；表觀消化率；消化酶

目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，對酶制劑的活性研究較多[1-2]，而對水產(chǎn)動物的生長性能和消化率研究的相對較少。與此同時，酶制劑品種很多，數(shù)量多達20余種，但常用的只有少數(shù)幾種。在國外，木聚糖酶用量最大，其次是β-葡聚糖酶，其它幾種酶制劑使用相對較少。近幾年國內(nèi)在非淀粉多糖酶和復合酶制劑的研究較多[3-5]，但對于飼料中添加外源性消化酶的研究較少。本文通過在魚粉含量較低而植物蛋白較高的吉富羅非魚飼料中加入中性蛋白酶，進行飼養(yǎng)試驗，研究中性蛋白酶對吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）的生長、表觀消化率及消化酶活性的影響，旨在探討中性蛋白酶在吉富羅非魚飼料中的應用效果和適宜的添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

在基礎飼料中分別加入不同濃度（0、0.05%、0.1% 、0.15%、0.2%、0.25%）的中性蛋白酶（活性50 000 U/g）配成試驗飼料，每組3個平行。試驗飼料制備時準確稱取相應質(zhì)量的中性蛋白酶與黏合劑（紅薯淀粉）混合，加入少量蒸餾水，攪勻后均勻噴灑到基礎飼料上，自然風干分裝，在常溫下避光保存?zhèn)溆?，每次拌料? d左右的投喂量為宜。

1.2 試驗條件

所用水族箱規(guī)格為110 cm×60 cm×80 cm，為自動循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。試驗用魚平均體重為（92.65±4.84）g/尾。

1.3 飼養(yǎng)管理

采用循環(huán)水養(yǎng)殖，根據(jù)水質(zhì)情況適當換水。試驗期間每天投餌2次，投餌時間分別為8：00和16：00。每天的投喂量相對穩(wěn)定，各水族箱間投餌量也相對穩(wěn)定，每次投喂以10 s時間吃完沒有殘餌為宜。全天24 h不間斷充氣。試驗期間水溫保持在 25～30 ℃，pH為 7.0～7.5。隨時觀測魚的活動、攝食情況，發(fā)現(xiàn)病魚，及時進行檢查，分析原因，采取相應的治療措施。

1.4 生長指標的測定

試驗開始前，對每個水族箱中的吉富羅非魚分別進行計數(shù)、稱重。飼養(yǎng)56 d后，停食24 h，對每組水族箱中所剩吉富羅非魚進行計數(shù)、稱重，空腹測定各組水族箱中吉富羅非魚終末體重，計算各試驗組吉富羅非魚的試驗初尾均重、試驗末尾均重、成活率、相對增重率、特定生長率和飼料系數(shù)。

1.5 飼料消化率的測定

飼料消化率采用水產(chǎn)動物表觀消化率測定方法（NY/T 2713-2015）。采用逐級稀釋的方法提前將Cr2O3混勻后均勻地加入到吉富羅非魚配合飼料中，添加量為1%。使用的Cr2O3為化學純，研碎后經(jīng)過100目篩。計算出飼料干物質(zhì)表觀消化率、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維的表觀消化率。

1.6 吉富羅非魚消化器官消化酶活性的測定

1.6.1 消化器官樣品的采集及酶液的制備 消化器官樣品的采集：飼養(yǎng)試驗結束后，投喂試驗飼料2 h左右，在每個處理組中分別隨機撈取3尾吉富羅非魚，將3尾吉富羅非魚解剖的肝胰臟樣品混合成一個樣品、將解剖的3個腸道樣品混合成一個樣品。操作如下：將吉富羅非魚從水簇箱中撈出，立即解剖，分別取出肝胰臟和腸道，放在有冰浴的培養(yǎng)皿上，此操作需在0～4 ℃條件下進行。分別剪除吉富羅非魚肝胰臟、腸道外壁或表面上的脂肪，用濾紙沾去肝胰臟、腸道上的血塊。

組織勻漿酶液的制備：取出腸道的內(nèi)容物，用4 ℃的冷卻蒸餾水將腸道內(nèi)壁沖洗干凈，再用潔凈的濾紙將腸道樣品表面水分吸除，然后用解剖剪將腸道剪碎，在分析天平上進行稱重（精確至0.01 g以上），將剪碎的腸道組織放入玻璃勻漿器中，加入適量4 ℃的冷卻蒸餾水，在冰浴中對腸道組織進行勻漿，再用4 ℃的冷卻蒸餾水將腸道組織勻漿液沖冼至離心管中，3次所用冷卻蒸餾水的重量為吉富羅非魚腸道樣品重量的10倍。然后在4 ℃條件下以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速將腸道組織勻漿液離心15 min，取其上清液做好標記后進行分裝，即為待測配液，放在4 ℃冰箱中保存，需要在24 h內(nèi)測定完畢。用同樣的方法制備吉富羅非魚肝胰臟組織勻漿待測酶液，放在4 ℃冰箱中保存，同樣需在24 h內(nèi)測定完畢。

1.6.2 蛋白酶活性測定 采用Forlin-酚試劑法進行測定。

1.6.3 淀粉酶、脂肪酶活性測定 采用淀粉酶、試脂肪酶劑盒比色法分別進行淀粉酶活性、脂肪酶的測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用（平均數(shù)±標準差）的方法進行表示，用 SPSS17.0 進行單因素方差分析，并結合Duncan 氏法進行多重分析比較，差異顯著水平為 P<0.05。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加中性蛋白酶對吉富羅非魚生長的影響

試驗吉富羅非魚攝食中性蛋白酶含量分別為0、0.05 %、0.10%、0.15%、0.20%和 0.25%的試驗飼料56 d后，得到中性蛋白酶對各試驗組吉富羅非魚生長影響見表1。endprint

由表1可知，試驗飼料中中性蛋白酶含量為0.1%～0.25%時，相對增重率和特定生長率均比A0和A1組顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低（P<005），它們之間差異不顯著（P> 0.05）。以02%添加的A4組相對增重率和特定生長率最高，飼料系數(shù)最低。吉富羅非魚在整個試驗期間成活率均無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 飼料中添加中性蛋白酶對飼料表觀消化率的影響

飼料中添加不同含量的中性蛋白酶對飼料表觀消化率測定結果見表2。

由表2可知，中性蛋白酶含量為0.1%～02%的各試驗組的干物質(zhì)表觀消化率均顯著高于空白對照組A0（P<0.05），各試驗組之間無顯著差異（P>0.05），當中性蛋白酶含量增加到025%時，干物質(zhì)表觀消化率反而有所下降，但與其他試驗組和對照組均無顯著差異（P>0.05）。中性蛋白酶含量為0.05%～0.25%的各試驗組的粗蛋白表觀消化率均顯著高于空白對照組A0（P<0.05），但各試驗組之間無顯著差異（P>005）。各試驗組的粗脂肪表觀消化率和粗纖維表觀消化率與對照組之間均無顯著差異（P>005）。

2.3 飼料中添加中性蛋白酶對消化酶活性的影響

飼料中添加不同含量的中性蛋白酶對消化酶活性的影響測定結果見表3。

由表3可知，吉富羅非魚攝食試驗飼料56 d后，其肝胰臟淀粉酶、腸淀粉酶、肝胰臟脂肪酶和腸脂肪酶在各試驗組間均無顯著差異（P>005）；肝胰臟蛋白酶活性隨著飼料中蛋白酶含量從0增加0.05%和0.1%而逐漸升高，然后隨中性蛋白酶含量繼續(xù)增加而逐漸降低，A2和A3組的肝胰臟蛋白酶活性顯著高于空白對照組A0和A5組（P<0.05），A2和A3組間則無顯著差異（P>0.05）；腸蛋白酶活性隨著飼料中蛋白酶含量從0增加0.15%而逐漸升高，以A3組的腸蛋白酶活性最高，顯著高于空白對照A0組和A5組（P<0.05），其他各試驗組與A0組均無顯著差異（P>0.05），A5組的腸蛋白酶活性低于A0組，但差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 對吉富羅非魚生長性能的影響

目前中性蛋白酶在水產(chǎn)動物配合飼料中的應用研究的還比較少。冷向軍（2008）等研究表明，在魚粉含量分別為6%、10%的鯉魚配合飼料中分別添加同樣含量的蛋白酶AG ， 鯉魚的增重率均能顯著提高、飼料系數(shù)明顯降低；但在魚粉含量為15%和20%的鯉魚配合飼料中分別添加同樣含量的蛋白酶 AG后， 鯉魚的增重率和飼料系數(shù)與對照組相比均無顯著的差異[6]。 陳建明等（2009）在體重為3 g左右的青魚魚種配合飼料中添加0.1%～0.3%的中性蛋白酶制劑，能顯著地提高青魚的增重率、降低鯉魚的飼料系數(shù)、提高經(jīng)濟效益[7]。

本試驗中，在吉富羅非魚配合飼料中添加01%～0.25%的中性蛋白酶，羅非魚的增重率和特定生長率均能得到顯著的提高，飼料系數(shù)得到明顯的降低。這與大多數(shù)研究者的研究結果相類似。本試驗吉富羅非魚的基礎飼料中魚粉含量較低，以豆粕等為主的植物性蛋白含量較高。分析其原因可能是由于植物蛋白含量較高的吉富羅非魚配合飼料中氨基酸存在不平衡的現(xiàn)象，且存在著胰蛋白酶抑制劑等多種抗營養(yǎng)因子，飼料蛋白質(zhì)的消化率較低，添加外源性中性蛋白酶后，不但補充了蛋白酶的數(shù)量，且外源性蛋白酶使飼料植物性蛋白中的抗胰蛋白酶的作用得到鈍化，消弱了其對飼料消化的負面影響，飼料蛋白質(zhì)的消化率和飼料利用效率得到了提高，使蛋白質(zhì)更好地用于魚體的生長，同時配合飼料的適口性也得到了改善，最終表現(xiàn)出吉富羅非魚生長速度的提高和飼料系數(shù)的降低。

3.2 對飼料表觀消化率的影響

評價配合飼料營養(yǎng)價值的重要指標之一是飼料的表觀消化率。不同種類的飼料原料對飼料消化率的影響尤為重要，不同的物質(zhì)在魚體內(nèi)消化時，在相應的消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等作用下，蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等水產(chǎn)動物不可直接吸收的大分子營養(yǎng)物質(zhì)會降解成氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等水產(chǎn)動物可直接吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì)。豆粕作為主要的植物蛋白源，雖然其粗蛋白含量較高，但其內(nèi)含有抗胰蛋白酶、大豆蛋白抗原等抗營養(yǎng)物質(zhì)，容易引起飼料消化率降低，也有可能引起動物中毒等不良反應。而在配合飼料中添加一定劑量的蛋白酶會消除抗胰蛋白酶等配合飼料中的抗營養(yǎng)因子，補充動物體自身蛋白質(zhì)消化酶的分泌不足，保護動物腸道絨毛膜的完整性，促進動物機體對蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高配合飼料中蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[8]。 Drew等（2005）在以菜粕、豌豆為主要蛋白源的虹鱒魚配合飼料中添加一定量的蛋白酶，虹鱒魚對配合飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化率得到了顯著提高[9]。陳建明等（2009）在體重為3 g左右的青魚魚種配合飼料中添加0.05%～0.3%的中性蛋白酶制劑蛋白質(zhì)表觀消化率得到顯著的提高， 而對飼料干物質(zhì)的表觀消化率沒有顯著影響[7]。

本試驗中在吉富羅非魚配合飼料中添加中性蛋白酶對飼料粗脂肪表觀消化率和粗纖維表觀消化率均無顯著影響，中性蛋白酶添加量為0.1%～0.2%的各試驗組的干物質(zhì)表觀消化率和粗蛋白表觀消化率均顯著高于空白對照組。與陳建明、奚剛、Drew等的研究結果基本一致。本試驗中當中性蛋白酶添加量增加到0.25%時，飼料蛋白質(zhì)的表觀消化率有所降低，這可能是因為動物自身的蛋白質(zhì)消化酶已足夠多，添加了外源蛋白酶反而抑制了動物消化道內(nèi)消化酶的分泌及其活性。

3.3 對消化器官消化酶活性的影響

蛋白酶是蛋白質(zhì)代謝過程中非常重要的一類消化酶，能催化分解肽鍵，將大分子的蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、肽和氨基酸等小分子的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進蛋白質(zhì)的消化，提高動物對蛋白質(zhì)的消化率和飼料利用率。國內(nèi)外有關在飼料中添加外源蛋白酶對水產(chǎn)動物消化器官消化酶活性影響的研究不是很多。冷向軍等（2008）研究表明，在鯉魚配合飼料（魚粉含量為 10%）中添加蛋白酶 AG 175 mg/kg 后，鯉魚腸道內(nèi)蛋白酶的活性得到了顯著提高[6]。陳建明等（2009）研究表明，在體重3 g左右的青魚魚種配合飼料中添加0.1%～0.3%的中性蛋白酶制劑，顯著提高了青魚的肝胰臟蛋白酶活性， 而對青魚腸道蛋白酶、腸道淀粉酶和肝胰臟淀粉酶的活性沒有產(chǎn)生顯著性的影響[7]。endprint

本試驗中在吉富羅非魚配合飼料中添加02%的中性蛋白酶，顯著提高了吉富羅非魚肝胰臟蛋白酶和腸道蛋白酶的活性，而對魚的肝胰臟淀粉酶、脂肪酶活性和腸道淀粉酶、脂肪酶活性沒有產(chǎn)生顯著影響。這與陳建明、冷向軍等的研究結果基本一致。在配合飼料中添加外源性蛋白酶能提高吉富羅非魚肝胰臟和腸道蛋白酶活性的原因可能是一方面添加的外源性蛋白酶直接參與了對配合飼料營養(yǎng)成分的降解，另一方面也促進了內(nèi)源性蛋白酶的分泌，提高了肝胰臟和腸道蛋白酶的活性，內(nèi)源性蛋白酶與外源性蛋白酶發(fā)生協(xié)同作用，共同提高魚對飼料營養(yǎng)成分的消化和吸收，從而提高吉富羅非魚對飼料的利用效率，羅非魚攝食較多的蛋白質(zhì)后又可促進羅非魚的生長。

4 結論

本試驗條件和營養(yǎng)水平下，在吉富羅非魚飼料中添加0.1%～0.2%的中性蛋白酶能顯著地提高吉富羅非魚的相對增重率和特定生長率，提高飼料報酬，降低飼料系數(shù)，顯著提高飼料干物質(zhì)、粗蛋白表觀消化率，提高吉富羅非魚肝胰臟和腸道內(nèi)蛋白酶的活性。綜合魚體相對增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、消化器官消化酶活性等各項指標，吉富羅非魚飼料中中性蛋白酶的添加量以飼料的0.1%～0.2%為宜。

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（收稿日期：2017-12-11）endprint