Fas/FasL與嬰幼兒血管瘤演變過程的關(guān)聯(lián)性研究

趙忠芳　張波　馬少林

[摘要]目的：研究（Fas/FasL自殺相關(guān)因子，factor associated suicide/factor as sociated suicide lire）表達在嬰兒血管瘤演變過程中每個階段的表達量并探求它們之間的關(guān)聯(lián)性。方法：選取在筆者醫(yī)院保存的嬰幼兒血管瘤病例標(biāo)本60例，并依據(jù)標(biāo)本所處血管瘤病理形態(tài)將其分成六個階段，采用EnVi sion免疫組化法和RT-PCR方法檢測Fas和FasL蛋白及mRNA的表達情況。結(jié)果：Fas蛋白在增生早期和中期時有部分表達量，在增生晚期時陽性細胞增多并且Fas mRNA表達量達到最大，從消退早期至晚期，F(xiàn)as表達量呈下降趨勢；FasL蛋白從增生中期開始出現(xiàn)表達，當(dāng)?shù)皆錾砥跁rFasL mRNA表達量最大且FasL蛋白表達量達到最大，從消退早期到晚期，F(xiàn)asL表達量呈下降趨勢。結(jié)論：Fas和FasL通過介導(dǎo)血管瘤細胞凋亡途徑來使嬰幼兒血管瘤自行消退，它們之間存在著密切聯(lián)系。

[關(guān)鍵詞]Fas；FasL；嬰幼兒血管瘤；關(guān)系；演變

[中圖分類號]R732.2 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）07-0060-03

嬰幼兒血管瘤是一種常見的兒童期皮膚腫瘤，男女發(fā)病比例為1：（3～5），多發(fā)于嬰幼兒頭面部并表現(xiàn)為剛開始快速增長但后期增長減慢最終又會部分自行消退。近年來，業(yè)內(nèi)對于嬰幼兒血管瘤自行消退的機制一直為研究熱點，有學(xué)者已指出細胞凋亡途徑可能就是其自行消退的主要原因，而且細胞凋亡途徑中主要通路就是Fas/FasL蛋白介導(dǎo)的死亡受體通路。本研究通過對60例嬰幼兒血管瘤標(biāo)本進行檢測，研究其Fas和FasL蛋白及mRNA的表達情況并找出其中的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)報道如下。

1資料和方法

1.1一般資料：選取2010年1月2016年12月在筆者單位住院的嬰幼兒血管瘤標(biāo)本60例，所有入選的標(biāo)本患兒均為未經(jīng)過治療且單純進行手術(shù)切除制備石蠟標(biāo)本，患兒年齡2～120個月，依據(jù)患兒病理標(biāo)本的形態(tài)將60例標(biāo)本分成6份，分別為增生早期、中期和晚期及消退早期、中期和消退晚期。增生早期6例標(biāo)本，患兒年齡2～3個月；增生中期8例標(biāo)本，患兒年齡4～6個月；增生晚期16例標(biāo)本，患兒年齡7～12個月；消退早期標(biāo)本10例，患兒年齡12～36個月；消退中期8例標(biāo)本，患兒年齡36～60個月；消退晚期標(biāo)本12例，患兒年齡60個月以上，所有標(biāo)本均是石蠟包埋。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色所需試劑：抗Fas和抗FasL抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司），隸屬兔源性多克隆抗體；二抗：羊抗兔多聚酶標(biāo)二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記。

1.2.2 RT-PCR所需試劑：Fas、FasL和β-ActinPCR引物設(shè)計序列，如表1所示。合成公司，中科院上海生物工程中心；PCR Ex Taq酶反應(yīng)系統(tǒng)，日本TaKaRa公司；抽提RNA和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript 1T，美國Gibco公司。

1.2.3免疫組化染色方法：實驗前將標(biāo)本用機器制成病理切片，約為4um厚度。對其進行Envision法免疫組化染色，各個免疫組化染色指標(biāo)用PBS液作為陰性對照，將細胞胞漿內(nèi)或細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)棕黑色或棕黃色物定義為陽性，其余為陰性。

1.2.4 RT-PCR：將標(biāo)本進行總RNA抽提并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR儀進行擴增，條件是90s94℃-30s50℃-30s72℃，總共30個循環(huán)，最后5min延伸時間，將擴增后的溶液進行瓊脂糖凝膠電泳并對凝膠圖進行吸光度值分析，每個樣品均檢測3次，計算公式如下：mRMA表達相對量=目的基因片段條帶的吸光度A值/同一樣本β-Actin條帶的吸光度A值。

2結(jié)果

2.1免疫組化染色：通過表1可以看出，F(xiàn)as蛋白在增生早期和中期時有部分表達量，細胞飽滿、致密，部分細胞有棕黃色染色，且陽性細胞數(shù)目增多，在增生晚期時陽性細胞增多，但從消退早期至晚期，F(xiàn)as表達量呈下降趨勢，且微血管內(nèi)皮細胞仍有微弱陽性染色；FasL蛋白的表達從增生中期開始，呈現(xiàn)少數(shù)陽性細胞，有的陽性細胞位于血管壁中，直到增生晚期時FasL蛋白表達量達到最大表達，陽性細胞增多，且均在細胞密集之處；從消退早期到晚期，F(xiàn)asL表達量呈下降趨勢，直至幾乎看不見陽性細胞。

2.2 RT-PCR：通過對Fas和FasL蛋白mRNA的電泳圖進行觀察，可以發(fā)現(xiàn)Fas mRNA在增生早期和中期有一定量表達，在增生晚期達到最高，進入消退期開始下降，等到消退完成其幾乎檢測不到，F(xiàn)asL mRNA從增生中期開始有少量表達并在增生晚期表達到最高，進入消退期仍然很高但在消退完成期又幾乎檢測不到，通過進行吸光度值分析可發(fā)現(xiàn)Fas和FasL蛋白的mRNA含量均是先升后降。增生早期、增生中期、增生晚期、消退早期和消退晚期患兒的臨床表現(xiàn)，見圖1。

3討論

哺乳動物細胞凋亡主要通過死亡受體通路和線粒體通路進行，其中死亡受體途徑主要涉及蛋白為Fas/FasL、caspase8和TNF等，線粒體途徑主要涉及蛋白為easpase9、細胞色素C和BAX等，這兩條途徑都是通過caspase3來完成最終的細胞凋亡，有學(xué)者經(jīng)過大量實驗證明線粒體途徑不會在血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡過程中發(fā)揮作用，因為在血管瘤中線粒體涉及蛋白均表達量低而且在增殖期和消退期均無明顯變化差異，故死亡受體途徑可能會在血管瘤細胞凋亡中發(fā)揮主要作用。CTL、Th1和NK細胞均會產(chǎn)生FasL，這些細胞數(shù)量增多和活性增強會促使細胞凋亡的發(fā)生，有文獻表明T細胞和樹突狀細胞的數(shù)量在血管瘤增殖期和消退期中明顯多于其消退晚期，在增殖早期嬰兒血管瘤細胞中的CD3+、CD4+和CD8+數(shù)量比較少，但到了增殖中期這三個指標(biāo)數(shù)量就顯著增多，等到消退晚期這三個指標(biāo)數(shù)量又顯著下降，并通過對微血管壁進行觀察發(fā)現(xiàn)上面有少數(shù)FasL+存在，說明其正在穿過微血管進入細胞團或者正與微血管壁細胞發(fā)生作用，故由此可以推出增生晚期細胞凋亡數(shù)量增多的原因是FasL的Tc和Th1的增多，所以說嬰幼兒血管瘤演變的重要因素是Fas和FasL蛋白介導(dǎo)免疫和凋亡機制，其演變過程應(yīng)屬于腫瘤免疫范圍。

嬰幼兒的免疫狀態(tài)也是其血管瘤細胞凋亡的一個重要影響因素，因為剛出生的胎兒其免疫系統(tǒng)尚未完全建立，其各種免疫細胞含量少，尤其由T細胞介導(dǎo)的細胞毒作用和樹突狀細胞功能弱或不完全，再加上此時嬰幼兒不能通過胎盤獲得母體的免疫因子，故胎兒出生后對外來和內(nèi)在抗原的免疫應(yīng)答能力低，近而容易誘發(fā)患兒出現(xiàn)血管瘤，而且有數(shù)據(jù)表明早產(chǎn)低體重兒血管瘤發(fā)病率極高，這都可以用新生兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全來解釋。隨著嬰幼兒免疫系統(tǒng)的建立逐步完善，T細胞開始分泌FasL和Fas受體促使嬰幼兒血管瘤細胞凋亡并降低血管瘤生長速度?；純涸缙谘芰龅奈⒀苁怯蓛?nèi)皮細胞和周細胞包圍形成，當(dāng)患兒的體內(nèi)免疫系統(tǒng)建立起來后T細胞通過識別周細胞并分泌大量FasL促使其凋亡，血管周圍的周細胞數(shù)量在消退早期時會降至很低，而致敏性T細胞也使得血管瘤內(nèi)皮細胞大量凋亡，這些均可以用來解釋消退早期微血管迅速閉塞并消失的原因。

綜上所述，F(xiàn)as和FasL通過介導(dǎo)血管瘤細胞凋亡途徑來使嬰幼兒血管瘤自行消退，它們之間存在著密切聯(lián)系。endprint