鲬魚肉酶解物抗氧化活性的研究

戴遙，吳勝軍，2，3，舒留泉，王祥鵬，徐亞軍，于夢(mèng)媛，盤賽昆，2，3，*

（1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇連云港222005；3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，淮海工學(xué)院，江蘇連云港222005；4.江蘇天邊漁村食品有限公司，江蘇連云港222005）

肽（peptide）是蛋白質(zhì)水解過(guò)程的中間生成物，具有多種生物活性，包括促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)抗疲勞、降血脂等生理作用，且食用安全性極高，容易被人體所吸收[1]。因此，在功能性食品添加劑與多肽藥物研發(fā)過(guò)程中，功能性短肽食品的開發(fā)與應(yīng)用必將對(duì)功能性食品產(chǎn)生不可替代的影響[2]。

鲬魚（Platycephalus indicus），又名狗腿魚、秘書魚等，屬于硬骨魚綱，鲬科。分布于太平洋西部和印度洋，我國(guó)黃海與渤海產(chǎn)量較大，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類。然而國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鲬魚的研究較少，大多集中在生物學(xué)方面[3]，對(duì)鲬魚中的各種活性物質(zhì)進(jìn)行研究尚未見報(bào)道。而魚類中蛋白質(zhì)含量豐富，是肽的主要來(lái)源，漸漸受到重視，李吉緒等[4]通過(guò)檢測(cè)鰱魚肽對(duì)DPPH自由基的清除作用、對(duì)羥自由基的清除作用和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用的能力來(lái)研究其體外抗氧化活性，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)酶解制得的鰱魚肽具有一定的抗氧化活性。厲望[5]以帶魚為原料，優(yōu)化帶魚蛋白的酶解條件，評(píng)價(jià)了酶解物的抗氧化特性，并采用多種分離技術(shù)方法對(duì)抗氧化肽進(jìn)行分離純化，得到抗氧化性最高的組分對(duì)自由基清除率比分離前提高了27%，表明分離純化能明顯提高帶魚抗氧化肽的抗氧化能力。因此，采用酶定向適度水解技術(shù)制備活性肽是其深加工和高值化利用的重要發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮活鲬魚：連云港水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；D-脫氧核糖、2-硫代巴比妥酸（生化試劑）：BIO BASIC INC（Canada）；谷胱甘肽（色譜級(jí)）：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；堿性蛋白酶等（食品級(jí)）；其他試劑均為分析純。

供試酶的活力分別為菠蘿蛋白酶13 996 U/g，胰蛋白酶14 995 U/g，堿性蛋白酶 14 588 U/g，胃蛋白酶34 727.4 U/g，木瓜蛋白酶7 485.6 U/g。

1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（ALpHA-4）：德國(guó)CHRIST公司；紫外分光光度計(jì)（UV754N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度（DH）的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]采用pH-stat法測(cè)定。

式中：V為堿液體積，mL；C為堿液的摩爾濃度，mol/L；m為底物質(zhì)量，g；40為水解液稀釋倍數(shù)。

1.3.2 清除羥自由基能力測(cè)定

采用酶解物對(duì)于Fenton體系產(chǎn)生羥自由基清除率的體外試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定[7-8]。

1.3.3 肽含量的測(cè)定

采用雙縮脲試劑法[9]，以氧化型谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品肽含量。

1.3.4 鲬魚酶解工藝

1.3.4.1 鲬魚的預(yù)處理

將新買回來(lái)的鲬魚去頭去內(nèi)臟，洗凈，瀝干，分裝，置于－40℃冰箱預(yù)凍48 h以上，取出置于托盤，放入冷凍干燥機(jī)中干燥，粉碎，用索氏抽提脫脂，再把石油醚揮發(fā)完畢之后用超微粉碎機(jī)再次粉碎，取出后分裝，放在干燥器內(nèi)，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 鲬魚蛋白酶解液的制備

準(zhǔn)確（0.001 g）稱取4 g鲬魚干粉放入三角瓶中，加200mL雙蒸水配液，調(diào)節(jié)pH值，加入一定的酶，在適當(dāng)?shù)臏囟认旅附?，?0 min測(cè)一次水解度，直到達(dá)到特定水解度為止，將酶解液裝于離心管中，10 000 r/min，4℃，離心15 min，取上清液，于冰箱中保存，備用。

1.3.5 酶的選擇

按表1控制5種酶在適宜的條件下酶解鲬魚，加酶量均為2 000 U/g蛋白，根據(jù)水解進(jìn)程確定適宜的酶。

表1 供試蛋白酶作用條件Table 1 Hydrolysis conditions of tested proteinase

1.3.6 酶解單因素試驗(yàn)

影響酶解作用的因素一般為pH值，溫度，加酶量，固液比，酶解時(shí)間5個(gè)單因素。以羥自由基清除率和水解度為指標(biāo)，考察各因素對(duì)堿性蛋白酶水解作用及產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

1.3.6.1 時(shí)間影響

固液比 1 ∶50（g/mL），pH=8，酶量 2 000 U/g蛋白，溫度 50 ℃，時(shí)間設(shè)置為 30、60、90、120、150 min。

1.3.6.2 pH值影響

固液比 1∶50（g/mL），溫度：50℃，酶量 2 000 U/g蛋白，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.6.3 溫度影響

固液比1∶50（g/mL），pH值取1.3.6.2確定的最適合的pH值，酶量2 000 U/g蛋白，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，溫度分別為 40、45、50、55、60 ℃。

1.3.6.4 酶量影響

固液比 1∶50（g/mL），溫度：取 1.3.6.3確定的最適溫度，pH值取1.3.6.2確定的最適合的pH值，酶解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定，酶量分別為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500U/g蛋白。

1.3.6.5 固液比影響

按固液比 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1 ∶50（g/mL）配成懸浮液，調(diào)整溫度、pH值、酶量至以上1.3.6.2～

1.3.6.4的試驗(yàn)結(jié)果確定的值，水解時(shí)間由1.3.6.1的試驗(yàn)結(jié)果確定值。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)清除率有顯著影響的因素，采用Design Expert 6.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，分析數(shù)據(jù)，構(gòu)建數(shù)學(xué)回歸模型，求解最優(yōu)參數(shù)，因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response experiment design

1.3.8 IC50測(cè)定

采用倍比稀釋的方法對(duì)樣品進(jìn)行系列稀釋，測(cè)定其對(duì)自由基的清除率，根據(jù)樣品的肽含量計(jì)算各稀釋度的肽含量，作圖，擬合量效關(guān)系，根據(jù)擬合方程計(jì)算IC50。

1.3.9 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

利用凝膠層析法測(cè)定酶解物的分子量分布，通過(guò)Sephadex G-15柱（φ1.1 cm×50 cm）進(jìn)行分析檢測(cè)。樣品的分子量通過(guò)洗脫體積根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 鲬魚蛋白酶解物清除·OH能力測(cè)定

鲬魚肉5種蛋白酶解液對(duì)·OH的清除作用如圖1。

由圖1可知，在5種供試酶中堿性蛋白酶的酶解物清除羥自由基的作用最強(qiáng)，水解30 min時(shí)供試酶的水解物均呈現(xiàn)較大的清除能力，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，不同酶的水解物清除羥自由基的能力出現(xiàn)不同的上下波動(dòng)，但堿性蛋白酶的水解物具有較穩(wěn)定羥自由基清除能力，所以選取堿性蛋白酶進(jìn)行下面的試驗(yàn)。

圖1 不同時(shí)間下酶解物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.1 The scavenging effect of hydrolysates on hydroxyl free radical in different times

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響如圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基的影響Fig.2 The effect of different time to scavenging of Alacasle

圖2顯示，羥自由基清除率在30 min時(shí)即達(dá)到了較高的水平，隨時(shí)間的延長(zhǎng)維持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)。水解度則隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢的升高趨勢(shì)，210 min時(shí)達(dá)到最大。

2.2.2 pH值對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

pH值對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.3 The effect of pH to scavenging of Alacasle

堿性蛋白酶水解物對(duì)羥自由基的清除能力在選定的范圍內(nèi)隨pH值增大波動(dòng)不大，偏堿條件下水解度相對(duì)較高。

2.2.3 溫度對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

溫度對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖4。

圖4 溫度對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.4 The effect of temperature to scavenging of Alacasle

圖4所示，堿性蛋白酶水解物清除羥自由基和水解度隨溫度的變化并不一致，50℃時(shí)水解度最大，但此時(shí)清除率處于較低的水平，55℃清除率和水解度都處在相對(duì)較高的水平，因此取55℃為適宜溫度。

2.2.4 加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

加酶量對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖5。

圖5 酶量對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.5 The effect of enzyme substrate ratio to scavenging of Alacasle

從圖5可以看出，堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的能力在加酶量為1 000 U/蛋白～2 500 U/g蛋白時(shí)無(wú)較明顯波動(dòng)，之后開始提升，清除率在3 000 U/g蛋白時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)酶量超過(guò)3 000 U/g蛋白時(shí)，清除率隨酶量增加而有所減小。隨著加酶量的增加，水解度一直保持在一定范圍內(nèi)，無(wú)明顯變化。

2.2.5 固液比對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基的影響

固液比對(duì)堿性蛋白酶水解物清除羥自由基能力的影響如圖6。

如圖6所示，堿性蛋白酶水解物對(duì)羥自由基的清除能力在1∶30（g/mL）時(shí)最大，隨著固液比增加而減小，當(dāng)固液比為1∶40（g/mL）時(shí)清除率最低，而后隨著固液比增加清除率也增加。水解度在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，但不顯著。

圖6 固液比對(duì)堿性蛋白酶清除羥自由基能力的影響Fig.6 The effect of solid-liquid ratioto scavenging of Alacasle

2.3 響應(yīng)面結(jié)果與分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，由響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)安排和結(jié)果分析見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)安排及結(jié)果Table 3 Experiment arrangement and results of response surface method design

經(jīng)Design-Expert 6.0.10分析發(fā)現(xiàn)，2FI模型合適擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，去除不顯著項(xiàng)后，模型方差進(jìn)行相應(yīng)分析如表4所示。

表4 優(yōu)化后的模型方差分析表Table 4 The ANOVA table of the model after optimization

續(xù)表4 優(yōu)化后的模型方差分析表Continue table 4 The ANOVA table of the model after optimization

從表4可以看出，模型和失擬項(xiàng)的P值分別為0.006 3與0.615 7，表明該模型擬合良好。模型的各項(xiàng)中，A項(xiàng)、C項(xiàng)、A與B的交互作用對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響（P≤0.01），B項(xiàng)、A與C的交互作用對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（0.05≤P≤0.1）。羥自由基清除率（SA%）與因素的回歸方程為：

SA/%=-1 446.812 49+209.133 94A+22.195 39B+12.841 71C-2.957 84AB-1.896 68AC

式中：A為pH值；B為溫度，℃；C為固液比，g/mL。

回歸模型的最優(yōu)解為：A=9.0、B=40、C=40，即最優(yōu)的酶解條件是：pH值為9.0、溫度為40℃、固液比為1 ∶40（g/mL）、加酶量 3 000 U/g蛋白、時(shí)間 180 min，在此條件下，SA的模型預(yù)測(cè)值為89.23%。

2.4 抗氧化肽的半清除濃度（IC50）

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。

圖7 肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of peptide

2.4.2 肽含量的測(cè)定

采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳條件進(jìn)行酶解得到酶解物，測(cè)得OD值，帶入肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酶解液的肽含量為3.02 mg/mL。

2.4.3 酶解物羥自由基清除率IC50

酶解物肽含量與羥自由基清除作用量效關(guān)系如圖8。

圖8 肽含量與羥自由基清除率的量效關(guān)系Fig.8 The relationship between hydroxyl radical scavenging and peptide content

如圖8所示，酶解物肽含量與羥自由基清除率呈很好的線性關(guān)系，采用Excel進(jìn)行線性擬合得到擬合方程，根據(jù)方程計(jì)算得IC50為0.58 mg/mL。

2.5 分子量分布測(cè)定

用pH7.5磷酸緩沖液作為洗脫液，流速0.7mL/min，上樣量為1.5 mL，QuadTecTM檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。測(cè)得Sephadex G-15柱的Vo（流動(dòng)相體積）是 17.95 mL，Vt（柱總體積）是 38.94 mL，根據(jù)保留各標(biāo)準(zhǔn)物的時(shí)間求出對(duì)應(yīng)的Ve（洗脫體積），L-酪氨酸（Mr=181.19）的 Ve是 49.81 mL，輔酶 I（NAD，Mr=681.44）的Ve是30.93 mL，短桿菌肽鋅（Bacit racin zinc，Mr=1 486.2）的 Ve是 23.82 mL，卡托普利（Mr=217.29）的Ve是45.14 mL，氧化型谷胱甘肽（Mr=612.63）的Ve是31.10。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)物Ve計(jì)算出有效分的配系數(shù)為Kav，制成標(biāo)準(zhǔn)物曲線如圖9。

圖9 SepHadex G-15柱標(biāo)準(zhǔn)物校準(zhǔn)Fig.9 Standard curve of Standard material on SepHadex G-15

采用凝膠過(guò)濾層析分析出鲬魚酶解物層析圖譜如圖10。

分子量分布采用凝膠過(guò)濾層析，峰1出現(xiàn)在168 min，峰 2出現(xiàn)在 192 min，峰 3出現(xiàn)在 216 min，峰4出現(xiàn)在230 min，又因?yàn)榱魉贋?.7 mL/min，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出峰1的相對(duì)分子質(zhì)量為3 010，峰2的相對(duì)分子質(zhì)量為2 163，峰3的相對(duì)分子質(zhì)量為794，峰4的相對(duì)分子質(zhì)量為268。

圖10 鲬魚酶解物SepHadex G-15層析圖譜Fig.10 Chromatography of hydrolysates of protein from Platycephalus indicus

3 結(jié)論

在供試的5種蛋白酶中堿性蛋白酶是最適合水解鲬魚蛋白制備具有抗氧化活性肽的水解酶。通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到堿性蛋白酶酶解鲬魚蛋白的最佳條件為：溫度40℃，時(shí)間180 min，pH=9.0，降低了水解溫度，縮短了水解時(shí)間，有效地提高了水解效率，在此條件下獲得的鲬魚酶解物清除羥自由基的IC50值為0.58 mg/mL，肽含量為3.02 mg/mL。分子量分布測(cè)定結(jié)果顯示，鲬魚蛋白酶解物主要是相對(duì)分子質(zhì)量為268～3 010的小肽和寡肽。

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