發(fā)酵雞血中菌種擴(kuò)大培養(yǎng)條件的優(yōu)化

梁肖娜，孔彥文，陶冬冰，孔繁華，韓宏嬌，吳尚，吳尚儀，岳喜慶

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

近年來，隨著人們生活水平的迅速的提高，我國(guó)畜禽業(yè)的發(fā)展也伴隨著突飛猛進(jìn)，畜禽的數(shù)量也不斷增加，因此動(dòng)物血液的數(shù)量也隨之增加[1]。隨著畜禽工業(yè)的發(fā)展，雞血的產(chǎn)量也迅速增加，但是目前我國(guó)對(duì)雞血的使用基本上沒有被開發(fā)和利用，相反而是直接被排放到畜禽屠宰場(chǎng)周圍的環(huán)境中，對(duì)環(huán)境的影響造成極其惡劣的影響[2]。除此之外，雞血的大量流失不僅造成了環(huán)境的嚴(yán)重污染，而且也使得蛋白質(zhì)原料的大量的浪費(fèi)。據(jù)調(diào)查研究顯示，畜禽類的動(dòng)物血液，尤其雞血是一種含有極其豐富的蛋白質(zhì)，大量的糖類、脂類、和氨類化學(xué)物質(zhì)，含有生命體所需要的大部分的氨基酸、礦物質(zhì)（鉀、鈉、鎂、磷、鐵）等物質(zhì)以無(wú)機(jī)鹽的形式存在[3]。因此，對(duì)于雞血的再次開發(fā)和利用，將會(huì)為我國(guó)創(chuàng)造更多和更加可觀的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

本試驗(yàn)從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益出發(fā)，利用微生物培養(yǎng)和發(fā)酵技術(shù)，篩選出適合雞血發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的發(fā)酵和生長(zhǎng)配方進(jìn)行篩選，研究出適合菌株發(fā)酵雞血的最佳的生長(zhǎng)條件，可以將雞血中大分子的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)分解成為更加適合，或者被動(dòng)物、植物直接吸收和利用的可溶性的小分子蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從而為雞血等其他類的動(dòng)物血液的而進(jìn)一步的研究與開發(fā)利用提供堅(jiān)實(shí)的理論和試驗(yàn)依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血：由沈陽(yáng)市偉峰肉雞加工廠提供；供式菌株，4種菌株（A7蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis、A8 希瓦氏菌 Shewanella sp.、B1 青霉菌屬Penicillium citreonigrum、B4塔賓曲霉Aspergillus tubingensi）：由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離篩選提供；液體培養(yǎng)基：由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室配制而成；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、牛肉浸粉、酵母浸粉、七水硫酸鎂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸銨、甲醛、乙酰丙酮、乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-C型恒溫震蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱東聯(lián)電子公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-1600紫外/可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；ACCULAB VICON電子精密天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；尼康生物顯微鏡：南京江南光電（集團(tuán)）股份有限公司；DW-86L486超低溫冰箱：德國(guó)Eppendorf公司；BCM-1000A生物潔凈工作臺(tái)：蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)勢(shì)菌種生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1.3.1.1 光電比濁計(jì)數(shù)法[5]

將1.1中得到的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，將活化好的菌株分別接種到50 mL的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，160 r/min、37℃搖床培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定各菌株在600 nm處的吸光值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制各優(yōu)勢(shì)菌株的生長(zhǎng)曲線，從而確定細(xì)菌制備種子液的最佳時(shí)間。

1.3.1.2 稱干重法[6-7]

將1.1中得到的霉菌優(yōu)勢(shì)菌株在霉菌斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，向活化后的菌種斜面中加入5 mL生理鹽水，用接種環(huán)刮下菌苔制成菌懸液。將此菌懸液再稀釋10倍后，在300 mL三角瓶中分別裝30 mL液體繁殖培養(yǎng)基，接種500 μL孢子懸浮液，30℃搖瓶培養(yǎng)，每隔24小時(shí)取出三角瓶，將培養(yǎng)液抽濾于定量濾紙上，用蒸餾水洗滌2次～3次，100℃～105℃烘至恒重，稱量菌體干重。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，干重為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線從而確定霉菌制備種子液的最佳時(shí)間。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)菌株種子液的制備[8]

首先用細(xì)菌和霉菌平板培養(yǎng)基分別對(duì)篩選分離得到的細(xì)菌和霉菌優(yōu)勢(shì)菌株在適宜的溫度條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后將活化好的細(xì)菌和霉菌優(yōu)勢(shì)菌株分別接入到裝有50 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，其中細(xì)菌在37℃，160 r/min，霉菌在30℃，160 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期取出，然后在4℃條件下，11 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，加無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行重懸，反復(fù)吹打液體，重復(fù)3次以上操作，最后將菌種濃度調(diào)至108個(gè)cfu/mL的數(shù)量級(jí)，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 游離氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定[9]

1.3.3.1 游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取硫酸銨0.472 0 g于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，充分振蕩混勻后放置4℃冰箱中備用，該溶液含氮量為1.0 mg/mL。使用時(shí)用移液槍吸取10 mL該溶液并定容至100 mL容量瓶，則該溶液含氮量為100 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定用移液槍分別準(zhǔn)確吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL的100 μg/mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放置于10 mL具塞比色管中，分別加4 mL乙酸銨緩沖溶液和4 mL顯色劑，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后劇烈震蕩1 min，放入到100℃水浴鍋中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。零管作為空白對(duì)照，將樣品在400nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值，根據(jù)各濃度下的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 雞血發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

吸取待測(cè)樣品1 mL定容到1 000 mL容量瓶中，充分震蕩混勻備用，用移液槍吸取1 mL樣品稀釋液放入到10 mL具塞比色管中，分別加4 mL乙酸銨緩沖溶液和4 mL顯色劑，加蒸餾水定容至10 mL，混勻后劇烈震蕩1 min，放入到100℃水浴鍋中加熱15 min，取出后冷卻至室溫。將樣品在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值。

1.3.4 單株菌株發(fā)酵雞血的效果測(cè)定[10]

用移液槍準(zhǔn)確吸取2.5 mL新鮮雞血于250 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入22.5 mL蒸餾水于上述錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無(wú)菌條件下分別將4株優(yōu)勢(shì)菌株種子液準(zhǔn)確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照5%的比例加入到已經(jīng)滅菌的新鮮雞血中，在其自然pH值的條件下，混勻放入到恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為160 r/min、28℃，恒溫發(fā)酵5天后取出，測(cè)定發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量，每組至少3個(gè)平行。

1.3.5 混合菌株發(fā)酵雞血的效果測(cè)定

用移液槍準(zhǔn)確吸取2.5 mL新鮮雞血于250 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入22.5 mL蒸餾水于上述錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無(wú)菌條件下將4株優(yōu)勢(shì)菌株種子液準(zhǔn)確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入到已經(jīng)滅菌的新鮮雞血中，在其自然pH值的條件下，混勻放入到恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為160 r/min、28℃，恒溫發(fā)酵5天后取出，測(cè)定發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量，每組至少3個(gè)平行。

1.3.6 混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 溫度對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

準(zhǔn)確配制自制液體培養(yǎng)基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無(wú)菌條件下將4株優(yōu)勢(shì)菌株種子液準(zhǔn)確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，調(diào)節(jié) pH=7，分別放在 28、30、32、34、36 ℃的中，同時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為160 r/min，恒溫培養(yǎng)12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測(cè)定5分菌液培養(yǎng)基的OD600吸光度值。

1.3.6.2 pH值對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

準(zhǔn)確配制自制液體培養(yǎng)基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無(wú)菌條件下將4株優(yōu)勢(shì)菌株種子液準(zhǔn)確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，分別調(diào)至pH值為4、5、6、7、8，將恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)在30℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測(cè)定5分菌液培養(yǎng)基的OD600吸光度值。

1.3.6.3 轉(zhuǎn)速對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

準(zhǔn)確配制自制液體培養(yǎng)基，裝入250 mL錐形瓶中，瓶口用封口膜密封，在121℃下滅菌20 min，于無(wú)菌條件下將4株優(yōu)勢(shì)菌株種子液準(zhǔn)確加入到錐形瓶中，種子液的添加量按照1∶1∶1∶1的體積比例加入，調(diào)節(jié) pH=7，分別調(diào)至搖床轉(zhuǎn)速為 100、120、140、160、180、200 r/min，將恒溫培養(yǎng)箱調(diào)節(jié)在30℃的條件下培養(yǎng)12 h，等待菌液靜置后，取適量上清液，分別測(cè)定5分菌液培養(yǎng)基的OD600吸光度值。

1.3.7 混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)工藝條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇溫度、pH值、轉(zhuǎn)速3個(gè)因素條件對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過Design Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析和比較來預(yù)測(cè)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的最優(yōu)的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design analysis

1.3.8 試驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面得到的混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的工藝條件后，按照最佳工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，最終驗(yàn)證響應(yīng)面的試驗(yàn)參數(shù)是否準(zhǔn)確可靠。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Excel、Design-expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)周期為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰亡期4個(gè)特征時(shí)期。菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定見圖 1、圖 2。

圖1 兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of two bacteria strains

如圖1所示，細(xì)菌A7蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis和A8希瓦氏菌Shewanella sp.的OD值在0～4 h時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)；但是在4 h～12 h時(shí)，菌液的OD值迅速增大，此時(shí)表明在4 h～12 h時(shí)，菌株的生長(zhǎng)正在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；12 h后菌液的OD值進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)并且逐漸趨于平穩(wěn)，表明此時(shí)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期；隨著時(shí)間的增長(zhǎng)大約在16 h后菌液的OD值逐漸降低，表明菌株逐漸進(jìn)入到衰亡期。綜上所述，種子液的制備時(shí)間制定在4 h～12 h之間內(nèi)進(jìn)行種子液的制備。從圖2中可以看出，霉菌B1青霉菌屬Penicillium citreonigrum、B4塔賓曲霉Aspergillus tubingensi的OD值在菌液培養(yǎng)的0～2 d時(shí)幾乎處于穩(wěn)定狀態(tài)，變化不大；2 d～7 d時(shí)霉菌的菌液OD值迅速增大，可以得出此時(shí)的霉菌菌株在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；到菌株生長(zhǎng)的7 d～9 d時(shí)菌液的OD值趨于穩(wěn)定狀態(tài)，變化微?。? d～10 d時(shí)，菌液OD值迅速降低，此時(shí)處于衰亡期。因此，最終將種子液的最佳制備時(shí)間最終確定在2 d～7 d內(nèi)。

圖2 兩株霉菌的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of two yeast strains

2.2 游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線

游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of free amino acid nitrogen

如圖3所示，試驗(yàn)以硫酸銨濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=0.007 3x+0.006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5，游離氨基酸態(tài)氮含量在0～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3 單株菌株發(fā)酵雞血的效果測(cè)定

單株菌株發(fā)酵雞血的效果見圖4。

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比較，各株優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮的影響效果均在不同程度上大于空白對(duì)照組，其中優(yōu)勢(shì)菌株A7和A8對(duì)雞血中游離氨基酸態(tài)氮的影響效果與空白對(duì)照組相比，在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有極顯著性差異（P≤0.01），A7和A8發(fā)酵雞血中產(chǎn)生的游離氨基酸態(tài)氮的含量分別為30.2、30.7 μg/mL，約是空白對(duì)照組中游離氨基酸態(tài)氮的含量的2倍左右。B1和B4對(duì)雞血中游離氨基酸態(tài)氮的影響效果與空白對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.5）。由此可以說明，各株優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)于發(fā)酵雞血的影響效果均有影響，每株優(yōu)勢(shì)菌株都可以利用發(fā)酵雞血，在一定程度上提高雞血中游離氨基酸態(tài)氮的含量，這有可能是由于每種菌株對(duì)于發(fā)酵雞血的能力各有差異所造成的，與各菌株在雞血發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類有一定的相關(guān)性。

圖4 單株菌株發(fā)酵雞血的效果Fig.4 The effect of single strain ferment chicken blood

2.4 混合菌株發(fā)酵雞血的效果測(cè)定

混合菌株發(fā)酵雞血的效果如圖5所示。

圖5 混合菌株發(fā)酵雞血的效果Fig.5 The effect of mixed ferment chicken blood

從圖5中可以看出，菌株混合后發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮的含量與空白對(duì)照組相比均有明顯上升，各混合組菌株對(duì)游離氨基酸態(tài)氮含量的影響效果差異極其顯著（P≤0.01），其中混合菌株 A7、A8、B1和B4組中游離氨基酸態(tài)氮含量約為41.7 μg/mL，約是空白對(duì)照組中游離氨基酸態(tài)氮含量的2.5倍左右。與此同時(shí)，與2.3中單株菌株發(fā)酵雞血的效果相比較，游離氨基酸態(tài)氮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單株菌株發(fā)酵雞血中的含量。因此可以說明，混合菌株的共同發(fā)酵的效果最好，確定混合菌株A7、A8、B1和B4組為發(fā)酵雞血的最佳菌株組合。

2.5 溫度對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

溫度對(duì)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌液OD600值也逐漸升高，當(dāng)菌液培養(yǎng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，菌液OD600值達(dá)到最大，但是隨著溫度降低，菌液OD600值也開始緩慢下降。這可能是由于混合菌株在溫度為30℃時(shí)，各菌株的生長(zhǎng)代謝最為旺盛，隨著溫度的逐漸升高，會(huì)阻礙各菌株的正常生長(zhǎng)和繁殖。因此最終確定混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳溫度為30℃。

圖6 溫度對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響Fig.6 Effect of temperature on expanded culture conditions of mixed strains

2.6 pH值對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

pH值對(duì)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH值對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響Fig.7 Effect of pH on expanded culture conditions of mixed strains

菌株只有在最適合培養(yǎng)液的pH值下，才可以促進(jìn)微生物菌株的生長(zhǎng)代謝和繁殖，否則會(huì)抑制微生物的生命活動(dòng)。如圖7所示，調(diào)節(jié)菌液的pH值從4到6時(shí)，菌液OD600值迅速上升，當(dāng)pH值為7時(shí)，OD600值達(dá)到高峰，之后逐漸迅速降低。由此可以說明，當(dāng)菌液pH值為7時(shí)，最適合各菌株的生長(zhǎng)，因此最終確定pH值為7是混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳pH值。

2.7 轉(zhuǎn)速對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響結(jié)果如圖8所示。

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)條件的影響Fig.8 Effect of speed on expanded culture conditions of mixed strains

由圖8可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的逐漸提高，菌液OD600值緩慢上升，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到140 r/min時(shí)，OD600值停止增加，并且隨著轉(zhuǎn)速的增加，值開始迅速下降。對(duì)微生物菌液的進(jìn)行攪拌，可以使菌液的流體速度增大，因此溶解氧的速度伴隨增加，這時(shí)候?qū)τ谖⑸锷L(zhǎng)和其產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化有一定的促進(jìn)效果。但是轉(zhuǎn)速的改變可以直接影響到氧氣的傳遞，因此最終確定搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min為混合菌株發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速條件。

2.8 混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)工藝條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.8.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析如表2和表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis test

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

依據(jù)表2中試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到如下多元回歸方程：Y=-621.143 20+24.123 63A+35.138 80B+1.994 00C-0.466 25AB-4.625 00×10-3AB-6.250 00×10-4BC-0.337 30A2-1.501 70B2-6.460 50×10-3C2

圖9 溫度和pH值對(duì)OD值的等高線（右）和響應(yīng)曲面圖（左）Fig.9 Temperature and pH on OD contour（right）and response surface map（left）

由表3可知，此模型的P＜0.000 1，說明OD值與所考察的自變量之間的線性關(guān)系極顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.998 9，修正后的確定系數(shù)R2Adj=0.997 8，說明該模型可以解釋99.78%的變化，擬合程度良好；其中失擬項(xiàng)P＞0.05，影響不顯著，說明所選的模型適合，可以用該模型來進(jìn)行擬合試驗(yàn)，一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著，可以說明對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著；對(duì)OD600的影響順序依次為pH值＞溫度＞轉(zhuǎn)速，即pH值對(duì)于OD600的影響較為顯著。

2.8.2 響應(yīng)面各因素間的交互作用分析與優(yōu)化

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程的的擬合，得到圖9～圖11的等高線和響應(yīng)面圖。

圖10 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)OD值的等高線（右）和響應(yīng)曲面圖（左）Fig.10 Temperature and speed on OD contour（right）and response surface map（left）

圖11 轉(zhuǎn)速和pH值對(duì)OD值的等高線（右）和響應(yīng)曲面圖（左）Fig.11 Speed and pH on OD contour（right）and response surface map（left）

從圖9種可以看出溫度和pH值交互作用對(duì)OD值的影響，響應(yīng)面圖可以清楚的看到溫度和pH值間形成響應(yīng)面的曲面變化幅度都較為明顯，說明溫度和pH值對(duì)OD值的影響非常顯著。從左側(cè)的等高線圖中可以看出，響應(yīng)面的最高點(diǎn)也是等高線圖中的最小圖形的中心點(diǎn)，溫度和pH值所形成的等高線圖形接近橢圓形，說明兩者間的交互作用極其明顯，這與二次多元回歸方程擬合的方差分析結(jié)果是相互一致的。圖10結(jié)果表明，溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)OD值的影響作用，可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度一定時(shí)，OD值隨著轉(zhuǎn)速的升高而增加，但是當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到140 r/min中時(shí)，OD值又開始逐漸的降低，除此之外可以看到，轉(zhuǎn)速的曲面變化幅度大于溫度，說明轉(zhuǎn)速對(duì)OD值的影響較為顯著，另外從等高線圖可以看出，溫度和轉(zhuǎn)速交互作用顯著。轉(zhuǎn)速和pH值對(duì)OD值的影響作用見圖11。從圖中可知，pH值的曲面變化幅度較小，而轉(zhuǎn)速的變化幅度較大，由此可以說明，轉(zhuǎn)速對(duì)OD值的影響作用大于pH值，同時(shí)也說明轉(zhuǎn)速對(duì)OD值的影響極顯著，這與二次多元回歸方程擬合的方差分析結(jié)果是一致的。

2.8.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6軟件求解回歸方程可以得到，混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳的工藝條件為：溫度30℃、pH=7、轉(zhuǎn)速140 r/min，在此最佳的條件下得到的OD值的理論值可以達(dá)到8.74。為檢驗(yàn)方程的可靠性，在此優(yōu)化的條件下進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，最終得到3次試驗(yàn)的OD值分別為8.66、8.78和8.85，平均值為8.76，這與該理論值較為接近，由此可以說明該響應(yīng)面對(duì)混合菌株擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳的工藝條件具有實(shí)際可操作性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以雞血作為發(fā)酵原料，研究?jī)?yōu)勢(shì)復(fù)合菌種擴(kuò)大培養(yǎng)條件，根據(jù)中心組合Box Behnken（BBD）的設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面的分析方法，并利用利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，得到OD值與溫度、pH值、轉(zhuǎn)速的回歸模型，并對(duì)方程進(jìn)行求解得到最佳的混合菌株的發(fā)酵條件為：溫度30℃、pH=7、轉(zhuǎn)速140 r/min，在此條件下OD值的理論值為8.74，在此條件下經(jīng)過驗(yàn)證性試驗(yàn)得到，菌液的平均OD值約為8.76，由此可以說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强煽亢侠?，具有一定的?shí)際的指導(dǎo)價(jià)值和意義。本試驗(yàn)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，研究雞血等動(dòng)物性食品綜合性開發(fā)，為新產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供新的思路和想法。

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