響應(yīng)面法優(yōu)化生姜蛋白酶活性測(cè)定方法

侯嬰惠，張秀娟，王帥，唐曉珍，*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271000；2.濟(jì)寧學(xué)院，山東曲阜273100）

酶作為一種生物催化劑，能夠通過降低從底物到產(chǎn)物的反應(yīng)活化能，在溫和環(huán)境條件下提高反應(yīng)速度[1-2]，因?yàn)槊妇哂写呋咝?、底物專一性等?yōu)勢(shì)，使其在食品、工業(yè)、醫(yī)藥、分子生物學(xué)等領(lǐng)域具有越來越廣泛的應(yīng)用[3-4]。目前在食品工業(yè)中開發(fā)利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶[5]、菠蘿蛋白酶[6-8]、無花果蛋白酶[9-11]以及相對(duì)研究較晚較弱的生姜蛋白酶[12-13]等，這些植物蛋白酶結(jié)構(gòu)與性質(zhì)均相似。生姜酶活測(cè)定常參照木瓜蛋白酶活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際試驗(yàn)中因生姜蛋白酶與木瓜蛋白酶并非完全相同，具體反應(yīng)溫度、時(shí)間等條件尚不統(tǒng)一，不能完全參照木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定[14]。近年來關(guān)于生姜蛋白酶的研究雖多有報(bào)道，但生姜酶活性具體測(cè)定條件尚未統(tǒng)一。宋琦等[13]以酪蛋白為底物，單位時(shí)間內(nèi)以生姜蛋白酶分解酪蛋白的生成物的量來表示酶活大小，此過程以需要加三氯乙酸等強(qiáng)酸終止反應(yīng)；周慧等[15]采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)生姜蛋白酶分解酪蛋白后溶液殘留蛋白，以此為指標(biāo)確定酶活大小，但此方法受溶液中雜質(zhì)影響較大，所測(cè)結(jié)果真實(shí)性有待考究；于潔等[16]以加熱生姜蛋白酶失活后樣液為對(duì)照，以考馬斯亮藍(lán)法直接測(cè)出蛋白酶活性，但具體工藝條件有待篩選。因此建立快速、準(zhǔn)確的生姜酶活測(cè)定方法非常重要。介于響應(yīng)面試驗(yàn)[17-19]周期短，回歸方程精確度高，能研究多因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)[20-23]，本試驗(yàn)以生姜蛋白酶活性為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)，篩選出主要影響因素，再進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而優(yōu)化了生姜蛋白酶活性測(cè)定工藝條件，為后續(xù)姜酶提取、純化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生姜蛋白酶：實(shí)驗(yàn)室提?。桓衫宜?、三氯乙酸：天津市博迪化工有限公司；半胱氨酸、BSA（牛血清白蛋白）：北京索萊寶有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；其他試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-5500型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4：上海梅香儀器有限公司；離心機(jī)TDL-40B：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制備

生姜洗凈切碎，稱取200 g，按1∶3（g/mL）料液比打漿，低溫（4℃）靜置2 h，離心取沉淀用磷酸緩沖液1 ∶4（g/mL）復(fù)溶，低速攪拌 15 min后再靜置 3 h，用四層紗布過濾后離心取上清液，加95%的乙醇至醇體積為60%，冰浴7 h離心取沉淀[24]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

本試驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)含量[25]。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.019 3x-0.018 7，R2=0.999 4，式中：x 為蛋白質(zhì)濃度，μg/mL；y為吸光度值。

1.3.3 生姜蛋白酶酶活力測(cè)定

生姜蛋白酶酶活測(cè)定條件：40℃水浴條件下，酶促反應(yīng)15 min降解酪蛋白產(chǎn)生TCA可溶的多肽增加量，以滅活的生姜蛋白酶為對(duì)照[22]，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得樣品中酶活力大小。酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=774.11x-8.590 1，R2=0.999，式中：x 為樣品吸光度；y 為酶活力，U。

1.3.4 生姜蛋白酶酶活測(cè)定單因素試驗(yàn)

生姜蛋白酶活性測(cè)定各單因素梯度設(shè)置：反應(yīng)溫度 20、30、40、50、60、70℃；反應(yīng)時(shí)間 1、3、5、7、9、11 min；酪蛋白底物濃度0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%；磷酸鹽緩沖液 pH5、5.5、6、6.5、7、7.5。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

在單因素的基礎(chǔ)上采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以生姜蛋白酶酶活為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，建立二次回歸模型，擬合得到二次回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶活性測(cè)定的影響

反應(yīng)溫度對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the activity of Ginger protease

控制酶活測(cè)定時(shí)間5 min，酪蛋白濃度0.6%，緩沖液pH6.5，考察溫度在20℃～80℃時(shí)酶活大小。在一定溫度下酶具有最大活性，此溫度稱為酶的最適溫度[8]。由圖1可知，隨著溫度的升高酶活增大，在溫度為40℃時(shí)酶活測(cè)定值最大。當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，隨著溫度升高酶活性逐漸降低趨于0，此時(shí)酶已失活變性[13]。所以，選擇反應(yīng)溫度為40℃。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性測(cè)定的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響Fig.2 Effect of reaction time on the activity of Ginger protease

控制酶活測(cè)定反應(yīng)溫度40℃，酪蛋白濃度0.6%，緩沖液pH6.5，考察反應(yīng)時(shí)間在1 min～11 min時(shí)酶活大小。由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活先增大后降低，反應(yīng)時(shí)間5 min時(shí)酶活測(cè)定值最大。隨著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增大，酶活緩慢降低，是因?yàn)? min時(shí)酶已充分參與反應(yīng)，隨著時(shí)間的增大，酶在40℃的水浴條件下逐漸失活。所以，選擇反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.1.3 底物濃度對(duì)酶活性測(cè)定的影響

底物濃度對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響見圖3。

圖3 底物濃度對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the activity of Ginger protease

控制酶活測(cè)定反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間5 min，緩沖液pH6.5，考察酪蛋白底物濃度在0.3%～1.8%時(shí)酶活大小。由圖3可知，在反應(yīng)溫度、緩沖液pH值適宜的條件下，酶促反應(yīng)隨底物濃度的增大迅速增大，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.9%時(shí)，底物濃度繼續(xù)增大，酶活性中心分子逐漸被飽和，反應(yīng)速度的增加率將會(huì)減少[26]。所以，選擇酪蛋白濃度為0.9%。

2.1.4 緩沖液pH值對(duì)酶活性測(cè)定的影響

緩沖液pH值對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響見圖4。

圖4 緩沖液pH值對(duì)生姜蛋白酶活性測(cè)定的影響Fig.4 Effect of buffer pH on the activity of Ginger protease

控制酶活測(cè)定反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間5 min，酪蛋白濃度0.9%，考察緩沖液pH值在5～7.5時(shí)酶活大小。由圖4可知，隨著緩沖液pH值的增大，酶活先增大后降低。pH值之所以影響酶的活性是因?yàn)榫彌_液pH值改變了酶活性部位相關(guān)的基團(tuán)的解離狀態(tài)[13]，當(dāng)緩沖液pH6.5時(shí)酶活最大，此時(shí)酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于酶與底物結(jié)合；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)酶活性突然降低，其原因?yàn)檫^堿使蛋白質(zhì)中的氫鍵、化學(xué)鍵斷裂或與游離的氨基或羧基形成鹽，從而使蛋白質(zhì)變性[16]。所以，選擇緩沖液為pH6.5。

2.2 響應(yīng)面法分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化生姜蛋白酶酶活測(cè)定條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果篩選出反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度、緩沖液pH值作為優(yōu)化條件，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果確定生姜蛋白酶酶活測(cè)定最佳方案。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表如表1，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平表編碼表Table 1 Factors and levels in central composite design

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results of central composite design

根據(jù)表1設(shè)定的水平和因素，以A（反應(yīng)時(shí)間）、B（反應(yīng)溫度）、C（底物濃度）、D（緩沖液pH值）為自變量，酶活（Y）為響應(yīng)值，按表2實(shí)施30次試驗(yàn)，并測(cè)得各條件下的酶活。所得回歸方程為：

酶活=-2 444.190 99+84.668 55A-2.676 57B+482.823 24C+665.213 34D-0.223 58AB+1.657 38AC-7.544 74AD+0.433 75BC+3.032 71BD-13.271 33CD-3.427 20A2-0.188 38B2-221.162 64C2-56.497 05D2

式中：Y 為酶活預(yù)測(cè)值；A、B、C、D 為上述 4個(gè)自變量的編碼值。

2.2.2 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。得到的回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation for the yield of xylan

P值的大小表明模型及各考察因素的顯著水平。P值小于0.05，表明模型或各因素有顯著影響；P值小于0.01，表明模型或各因素高度顯著。從表3可知，以酶活為響應(yīng)值時(shí)，模型P＜0.010 0，表明該二次方程模型極顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.133 1＞0.100 0，表示正交試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，即可用該數(shù)學(xué)模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。由表3還可以看出，4個(gè)因素中A、B、C影響極顯著，AD、BD、A2、B2、C2、D2影響極顯著，D、AB、AC、BC、CD、影響差異不顯著，其結(jié)果表明在酶活測(cè)定時(shí)，反應(yīng)時(shí)間、溫度、底物濃度均對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大影響。雖然過酸或過堿性條件可使蛋白變性，但在響應(yīng)面試驗(yàn)過程中溶液緩沖液pH值均在7左右，因此測(cè)定結(jié)果表明D緩沖液pH對(duì)酶活測(cè)定影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析及酶活測(cè)定工藝優(yōu)化

響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化通過Design Expert8.0.6軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖。圖5分別顯示6組以酶活為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖。從其等高線圖可直觀反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。

由圖5響應(yīng)面立體圖和等高線圖形可知：反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間和緩沖液pH值、反應(yīng)溫度和緩沖液pH值交互作用對(duì)酶活測(cè)定影響均顯著；圖5D、5F中等高線圖形趨于圓形，反應(yīng)溫度和底物濃度、底物濃度和緩沖液pH值交互作用不顯著。

圖5E（a）響應(yīng)面隨著pH值的增大酶活先增大后降低，變化幅度較??；隨溫度的增大酶活先增大后降低且變化幅度較大。這主要是由于較高或較低的pH值使蛋白質(zhì)氫鍵斷裂引起酶變性失活；適當(dāng)提高酶活測(cè)定溫度可提高酶催化活性，當(dāng)溫度高于酶活反應(yīng)最佳溫度時(shí)，測(cè)定溫度越大酶易變性失活[13]。因此酶活測(cè)定時(shí)要選擇合適的緩沖液pH值及測(cè)定溫度。

圖5 兩因素交互作用對(duì)生姜蛋白酶活測(cè)定的等高線和響應(yīng)面Fig.5 Response surface and contour plots showing two factors effects on the activity of Ginger protease

由各響應(yīng)面立體圖可看出，響應(yīng)值存在最大值。通過軟件分析計(jì)算得出理論最佳提取工藝：反應(yīng)時(shí)間3.6 min，反應(yīng)溫度46.45℃，底物濃度0.95%，緩沖液pH6.78，其預(yù)測(cè)值為130.46 U。為檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用上述條件測(cè)定酶活為133.15 U，表明該試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合良好。

3 結(jié)論

采用Design-Expert 8.0.6軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型。方差分析結(jié)果表明反應(yīng)溫度和時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物濃度、反應(yīng)溫度和緩沖液pH值、反應(yīng)時(shí)間和底物濃度的交互作用對(duì)酶活測(cè)定影響均顯著，反應(yīng)時(shí)間和緩沖液pH、底物濃度和緩沖液pH交互作用不顯著。通過軟件分析得出生姜蛋白酶活性測(cè)定最佳條件：反應(yīng)時(shí)間3.6 min，反應(yīng)溫度46.44℃，底物濃度0.95%，緩沖液pH6.78，此條件下生姜蛋白酶活130.46 U，驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得生姜蛋白酶活性為133.15 U，與預(yù)測(cè)值吻合。

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