免疫磁珠-PCR試紙條快速檢測食品中牛源成分方法的建立

趙良娟，李宗夢，王淞，張宏偉，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

近年來，食品質(zhì)量與安全問題成為我國及國際社會普遍關注的熱點問題。由于經(jīng)濟利益的驅動，一些不法分子為牟取暴利，在畜肉和禽肉制品中攙雜使假、以假亂真，以價格低廉的畜禽肉代替價格高的畜禽肉，市場亂象令人堪憂[1-5]。尤其是2013年初，影響歐洲16個國家的“馬肉丑聞”事件[6]中，造假者使用來源于退役的賽馬肉冒充牛肉，多家企業(yè)召回數(shù)以百萬計“牛肉”漢堡。該食品安全事件引發(fā)了公眾對食品安全的擔憂以及各國政府的高度關注。

國內(nèi)外的學者應用PCR及實時熒光PCR技術對食品中牛、羊、馬、豬、雞、鴨等動物源成分進行了有效鑒別[7-12]，我國于2008年發(fā)布了食品中牛成分檢測的實時熒光PCR方法的行業(yè)標準[13]，標準中采用商品化硅膠柱層析法試劑盒提取食品DNA，再采用商品化實時熒光定量PCR試劑盒對牛成分進行檢測。

硅膠層析柱法商品化試劑盒多步離心操作耗時長，不利于自動化操作，尤其對于深加工食品核酸提取純度低，耗時長。免疫磁分離技術給深加工食品DNA提取帶來了新的方法，該方法提取DNA無需使用有機溶劑對蛋白進行抽提變性，省去了離心步驟，綠色環(huán)保，且易于實現(xiàn)自動化。

實時熒光定量PCR技術具有高效、快速的優(yōu)點，但是需要大型儀器設備和進口試劑，價格昂貴，且對操作人員有較高的技術要求。當食品安全事件發(fā)生時，往往需要將樣品送到具備檢測能力的實驗室花費數(shù)天時間進行檢測，為食品安全現(xiàn)場監(jiān)管和迅速響應帶來了困難。

因此，開發(fā)高效的核酸前處理和低成本、易操作、具有較高的靈敏度、準確度的現(xiàn)場快速檢測的方法用于樣品初篩，不僅能夠降低成本、解決依賴大型設備等問題，而且可以滿足食品摻假問題控制與監(jiān)管的需要，具有重要意義。

膠體金免疫層析法（goldimmunochromagraphy assay）是20世紀80年代末發(fā)展起來的一種快速的免疫學測定方法[14]，是膠體金標記技術和免疫層析技術相結合的產(chǎn)物，基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，使抗原抗體發(fā)生反應，在檢測線位置，陽性反應在試紙條上出現(xiàn)紅色條帶，陰性反應不顯色。

PCR與通用核酸檢測免疫金標層析試紙條相結合的方法具有快速、高效、成本低等優(yōu)勢，通過核酸引物兩端修飾相應標記物（如生物素、熒光素），同時試紙條上相應位置標記對應抗體，就可以實現(xiàn)PCR擴增產(chǎn)物的試紙條檢測。目前該技術已應用于食品中致病菌的檢測[15-16]。

本研究應用免疫磁分離方法提取食品中的核酸，根據(jù)牛線粒體基因組特異性基因片段設計引物，建立免疫磁分離結合PCR-試紙條快速檢測食品中牛成分的方法，為檢測和鑒別食品中牛成分提供一種快速、簡便的分子生物學初篩方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

試驗所用雞、鴨、鵝、鵪鶉、貓、狗、鼠、豬、馬、牛 、水牛、羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍、胡蘿卜、白菜為天津出入境檢驗檢疫局提供，所有樣品經(jīng)基因組測序和比對確認為相應物種。市售樣品包括鮮牛肉、冷凍牛肉、醬牛肉、番茄牛排、牛肉干、牛肉醬，均購自超市。

1.1.2 試劑

磁珠法基因組DNA提取試劑、RNase酶（4 mg/mL）dNTP Mixture、10X PCRbuffer（Mg2+Plus）、Taq DNA polymerase（TaKaRa-TagTM）：Promega生物技術公司；瓊脂糖：sigma公司；Loading buffer，DNA分子量標準：天根生化科技有限公司；核酸通用試紙條及展開液：北京華大蛋白研發(fā)中心有限公司。

1.1.3 設備

PCR 擴增儀（T00）、凝膠成像儀（XR+）：Bio-Rad公司；離心機（5417R）：Eppendorf公司；電泳儀（P25）：Biometra公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬摻假樣品的制備

以牛肉為陽性樣品，以駱駝肉模擬摻假樣品，將牛肉與駱駝肉切片，60℃烘干，研磨成粉末，過18目篩篩取粉末，制備牛肉/駱駝肉的混合模擬樣品，以牛肉肉粉的質(zhì)量百分比為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混勻，制備不同質(zhì)量百分比的牛肉模擬摻假樣品。

1.2.2 DNA的提取

稱取500 mg樣品放入EP管中，加入500 μL Lysis buffer A，5 μL RNase酶；加入 250 μL Lysis buffer B，振蕩，室溫10 min；加入750 μL沉淀劑，劇烈振蕩，13 000 r/min離心10 min；取上清液于另一EP管中，加入50 μL磁性微球（約0.1 g/mL），加入0.8倍體積異丙醇，室溫5 min，翻轉混勻，磁分離后除去液體；加入250 μL Lysis buffer B，磁分離后除去液體；加入70%乙醇1 mL洗滌，共洗3次，除去乙醇，室溫晾干；加入100 μL TE，65℃水浴5 min。磁分離后，收集洗脫液。

1.2.3 引物設計

根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的牛線粒體基因組序列為依據(jù)，以牛線粒體基因組Cytb區(qū)域為靶標，應用Geneious 6.1序列分析軟件進行引物設計，設計了一對牛線粒體DNA Cytb區(qū)的引物，上游引物為F1，下游引物為R1，目的片段561 bp。試紙條檢測用的上下游引物分別用異硫氰酸熒光素（FITC）和生物素（biotin）標記，上游引物為F2，下游引物為R2，引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.4 PCR擴增

1.2.4.1 PCR反應體系

模板 DNA 1.0 μL，PrimerF1/R1 或 F2/R2 0.8 μL，dNTP mixture 2.0 μL，10X PCRbuffer（Mg2+Plus）2.0 μL，ExTaqHotStart（TaKaRaTaqTM）0.2μL，ddH2O13.2μL，總體積20 μL。反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30 個循環(huán)后進入72℃5 min。

1.2.4.2 電泳檢測

PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓100 V，電流110 A，時間40 min，檢測有無目的條帶。

1.2.4.3 試紙條檢測

取5 μL PCR產(chǎn)物點于核酸試紙條樣品墊，再滴加95 μL展開液進行檢測，5分鐘后觀察結果。試紙條質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為有效結果，檢測帶出現(xiàn)紅色為可疑陽性，檢測帶未出現(xiàn)紅色為陰性，可疑陽性樣品需進行測序或熒光PCR方法驗證[13]。

1.2.4.4 測序

PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后送去上海生工進行測序。

1.2.5 特異性、靈敏度和穩(wěn)定性檢測

1.2.5.1 引物的特異性檢測

以?；蚪MDNA為陽性對照品，選擇雞、鴨、鵝、鵪鶉、貓、狗、鼠、豬、馬、水牛、羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍及胡蘿卜、白菜等的基因組DNA為陰性對照，以無菌水為空白對照，用建立的PCR-試紙條方法進行檢測，以鑒定引物的特異性。

1.2.5.2 方法的靈敏度檢測

以牛肉為陽性樣品，100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%等不同質(zhì)量百分比的牛肉/駱駝肉混合模擬樣品，提取基因組DNA，用建立的PCR-試紙條方法進行檢測，并與電泳檢測結果進行比較，以驗證方法的靈敏度。

1.2.5.3 方法的穩(wěn)定性檢測

用建立的PCR-試紙條法對0.01%牛肉和駱駝肉混合樣品的DNA進行低限穩(wěn)定性檢測，重復檢測20次，以牛肉、駱駝肉的DNA為陽性對照和陰性對照。

1.2.6 市售樣品的檢測

1.2.6.1 售樣品磁珠法提取核酸

以購自超市的生鮮牛肉、冷凍牛肉、醬牛肉、番茄牛排、牛肉干、牛肉醬等不用加工方式處理的深加工牛肉制品為樣品，應用磁珠法提取核酸，檢測核酸的純度。

1.2.6.2 市售樣品的PCR-試紙條方法檢測

對購自超市的生鮮牛肉、冷凍牛肉、醬牛肉、番茄牛排、牛肉干、牛肉醬等36份樣品，應用所建立的免疫磁珠分離結合PCR-試紙條方法檢測牛源性成分。

2 結果與分析

2.1 引物的特異性

利用所設計的引物，以1.2.4PCR-試紙條反應體系及程序進行特異性檢測，試紙條結果如圖1所示。

圖1 牛源性成分特異性引物PCR-試紙條檢測結果Fig.1 Species specificity of PCR immune-lateral flowstrips with bovine primers

陽性樣品PCR擴增產(chǎn)物試紙條檢測帶和質(zhì)控帶均為紅色，結果為可疑陽性，而其他動植物樣品均只有質(zhì)控帶變紅色，檢測帶無色，結果陰性。

2.2 PCR產(chǎn)物的序列

將引物F1，R1擴增的牛擴增產(chǎn)物送去測序，測序結果如下，經(jīng)比對，符合率為99%。

AATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACCTCTTATCAGCAATCCCATACATCGGCACAAATTTAGTCGAATGAATCTGAGGCGGATTCTCAGTAGACAAAGCAACCCTTACCCGATTCTTCGCTTTCCATTTTATCCTTCCATTTATCATCATAGCAATTGCCATAGTCCACCTACTATTCCTCCACGAAACAGGCTCCAACAACCCAACAGGAATTTCCTCAGACGTAGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTATACCATTAAGGACATCTTAGGGGCCCTCTTACTAATTCTAGCTCTAATACTACTAGTACTATTCGCACCCGACCTCCTCGGAGACCCAGATAACTACACCCCAGCCAATCCACTCAACACACCCCCTCACATCAAACCCGAGTGATACTTCTTATTTGCATACGCAATCTTACGATCAATCCCCAACAAACTAGGAGGAGTACTAGCCCTAGCCTTCTCTATCCTAATTCTTGC

2.3 方法靈敏度

以不同質(zhì)量百分比的牛肉/駱駝肉模擬摻假樣品為研究對象，應用磁珠法提取DNA后，采用建立的PCR-試紙條反應體系進行靈敏度檢測，試紙條檢測結果如圖2A所示，當牛肉在混合肉品中的比例為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%時，試紙條質(zhì)控帶和檢測帶均能顯示紅色條帶，最低檢測限可達0.01%，比電泳（見圖2B）靈敏度高10倍。

圖2 牛源性成分靈敏度電泳及PCR-試紙條檢測結果Fig.2 Sensitivity of bovine specific PCR in meat mixture

2.4 方法穩(wěn)定性

用建立的PCR-試紙條法對0.01%的牛肉和駱駝肉混合樣品的DNA進行20次低限穩(wěn)定性檢測，結果發(fā)現(xiàn)0.01%牛肉/駱駝肉樣品，20次試紙條檢測檢測線均變紅，說明檢測低限的穩(wěn)定性好。

2.5 市售樣品的檢測

2.5.1 免疫磁珠分離法提取核酸

應用免疫磁珠法提取市售樣品包括鮮牛肉、冷凍牛肉、醬牛肉、番茄牛排、牛肉干、牛肉醬的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，6份市售樣品的A260/A280和A260/A230的比值均在1.8～2.0之間，說明磁珠法提取牛肉樣品，尤其是加工肉制品DNA的純度高，去除蛋白及雜質(zhì)的效果好。

2.5.2 PCR-試紙條檢測

應用所建立的PCR-試紙條方法對市售樣品包括鮮牛肉、冷凍牛肉、醬牛肉、番茄牛排、牛肉干、牛肉醬各6份，共36份樣品進行牛源性成分檢測，32份樣品檢出牛成分，4份樣品未檢出牛源成分，檢測結果與現(xiàn)行行業(yè)標準檢測結果一致，說明所建立的免疫磁珠結合PCR-試紙條方法能夠快速檢測加工食品中牛源性成分。

3 結論

3.1 DNA的提取

核酸前處理是分子生物學的基礎，獲得高純度的DNA模板是基因水平檢測的關鍵。實際加工食品中成分較復雜，且受到各種加工處理，在對物種進行真?zhèn)舞b定的初期，建立尋找合適的核酸前處理方法非常有必要，DNA的斷裂、提取中存在的PCR抑制劑都對后續(xù)研究產(chǎn)生重要的影響，在對食品進行真?zhèn)舞b定之前，DNA提取技術的選擇非常重要。

傳統(tǒng)的DNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法和十二烷基磺酸鈉（SDS）法，提取過程中包括多次有機溶劑抽提、醇沉淀和離心等步驟，操作繁瑣，污染環(huán)境，費時費力。商品化的硅膠層析柱法試劑盒需要多步離心操作不僅耗時長，而且不利于自動化操作。

本研究應用免疫磁珠法提取市售樣品的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，6份市售樣品的A260/A280和A260/A230的比值均在1.8～2.0之間，說明磁珠法提取牛肉樣品，尤其是加工肉制品的DNA純度高，去除蛋白及雜質(zhì)的效果好。

采用的磁珠法提取核酸操作簡便、步驟簡單、快速，提取的DNA純度高，不需有機溶劑提取，可配合高通量自動化磁珠提取儀，進行高通量檢測，尤其適合深加工食品核酸的提取。

另外，加工食品可能富含鹽、糖、植物色素和發(fā)酵產(chǎn)生的有色物質(zhì)等，會影響下游試驗操作，應通過洗滌方式的盡量去除樣品中的鹽、糖和色素，再進行DNA的提取操作。

3.2 引物的設計

高等動物的所有組織細胞中均含有大量的線粒體，線粒體DNA在不同的物種間具有高度的變異性。不同種類的動物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區(qū)域，但也存在一定的變異區(qū)域。在以線粒體DNA序列進行物種的種屬鑒別時，常用的區(qū)域包括編碼細胞色素B的Cytochrome b基因（cytB）、核糖體小亞基12S RNA編碼序列（12S ribosomal RNA）、細胞色素C亞基I（cytochrome C oxidase subunit I）的編碼基因coxI、編碼ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制區(qū)D-loop片段。這些區(qū)域的序列變異適中，既在種內(nèi)有一定的保守性，又體現(xiàn)出一定的種間差異。線粒體DNA是一個比較理想的用于檢測的靶基因。

本文以牛線粒體基因組序列為依據(jù)，設計其Cytb基因區(qū)間的物種特異性引物，并在兩端標記異硫氰酸鹽（Fluorescein 5-isothiocyanate，F(xiàn)ITC） 和生物素（Biotin），用含有金標記的抗異硫氰酸鹽的兔多克隆抗體和固定有鏈親和素的通用核酸檢測試紙條對PCR產(chǎn)物進行篩選檢測，從而建立了食品中牛成分快速檢測的PCR-試紙條方法。

3.3 方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性和市售樣品檢測

一種好的分子生物學方法應具有較高的特異性、靈敏度與穩(wěn)定性。本試驗中引物特異性試紙條試驗結果表明，只有含牛成分的樣品檢測線和質(zhì)控線均變紅，檢測結果為可疑陽性，而其它常見動植物樣品雞、鴨、鵝、鵪鶉、豬、馬、鼠、水牛、綿羊、驢、鹿、駱駝、胡蘿卜、白菜等試紙條檢測線均未變紅色?？梢申栃訮CR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，比對，與牛同源性為99%，說明所設計的牛特異性引物具有較好的物種特異性。從靈敏度試驗結果來看，該試驗PCR-試紙條檢測靈敏度達到0.01%，比電泳檢測靈敏度高10倍。用建立的PCR-試紙條法對0.01%牛肉和駱駝肉混合樣品的DNA進行20次低限穩(wěn)定性檢測，結果發(fā)現(xiàn)0.01%牛肉/駱駝肉樣品，20次試紙條檢測質(zhì)控帶和檢測帶均變紅，說明所建立的PCR-試紙條方法穩(wěn)定性好。

對市售36份樣品的檢測，32份樣品檢出牛成分，4份樣品未檢出牛源成分，檢測結果與現(xiàn)行行業(yè)標準檢測結果一致，說明所建立的免疫磁珠結合PCR-試紙條方法能夠有效的檢測加工食品中牛源性成分。檢測結果也說明市售加工牛肉制品存在不同程度的摻假，與標簽成分不符合現(xiàn)象。

3.4 方法的應用前景

本實驗中所應用的免疫磁珠分離結合PCR-通用核酸檢測免疫金標層析試紙條的檢測方法與已有的牛成分檢測的PCR電泳和熒光PCR方法相比，核酸提取省時、高效、環(huán)保而且不需要電泳儀、凝膠成像儀和熒光PCR等儀器，應用成本大大降低。所使用的PCR產(chǎn)物檢測試紙條是通用型試紙條，大大簡化核酸擴增后的檢測程序，縮短檢測時間。該方法充分利用PCR檢測的高靈敏度、特異性強的特點，又結合了免疫金標試紙條簡便、快捷、成本低的優(yōu)勢，為檢測和鑒別食品中動物源性成分提供一種快速、簡便、低成本的分子生物學初篩方法，能夠實現(xiàn)食品中動物源性成分的現(xiàn)場快速檢測，進而為食品安全監(jiān)管提供技術支持與保障。

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