紅曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化分析

嚴(yán)敏嘉，李小芳，趙甜甜，仲粒，吳純潔，何祖新，羅佳，*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137；2.四川得恩德藥業(yè)有限公司，四川綿陽(yáng)612000）

紅曲由紅曲霉屬真菌接種于大米發(fā)酵而成[1]。明代《本草綱目》記載[2]：“紅曲，性溫、味甘，消食活血，健脾燥胃”。目前，關(guān)于紅曲的糖類成分研究多停留在液態(tài)發(fā)酵上[3]，大多學(xué)者對(duì)紅曲液態(tài)發(fā)酵中的多糖進(jìn)行提取，純化和含量測(cè)定，再對(duì)多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究[4]，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵紅曲中糖類物質(zhì)的提取及含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道罕見(jiàn)。所以本研究對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲糖類成分如總糖、還原糖、多糖和淀粉含量建立提取和檢測(cè)方法，并分析發(fā)酵過(guò)程中糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，以期為工廠的紅曲發(fā)酵糖類物質(zhì)炮制機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不 同 發(fā) 酵 天 數(shù)（1、3、6、9、12、15、22、30、45、60、75、90 d，一共12組）固態(tài)發(fā)酵紅曲樣品：四川得恩德公司。

D（+）-無(wú)水葡萄糖：中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-15041507；α-淀粉酶（50 U/mg）：sigma 公司；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、鹽酸、酒石酸鈉鉀、無(wú)水亞硫酸鈉，苯酚、蒽酮、濃硫酸、乙醇、石油醚、正丁醇、三氯甲烷：成都市科化工試劑廠，均為分析純。

酚酞指示劑[5]：取酚酞1 g，加乙醇100 mL超聲溶解，即得。

甲基紅指示劑[5]：取甲基紅0.1 g，加0.05 mol/L氫氧化鈉溶液7.4 mL使溶解，再加水稀釋至200 mL即得。

DNS 試劑[6]：稱取 3，5—二硝基水楊酸（2.5±0.1）g，置于約150 mL水中，逐漸加入0.1 mg/mL氫氧化鈉25 mL，在50℃水浴中（磁力）攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉50 g、苯酚（重蒸）0.5 g和無(wú)水亞硫酸鈉1.25 g，待全部溶解澄清后，冷卻至室溫，用水定容至250 mL，過(guò)濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置一周后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

BP211D AG型電子天平：德國(guó)Satorius公司；DFD-700電熱恒溫水浴鍋：北京國(guó)華醫(yī)療器械廠；UPT-I-10T型超純水器：成都超純科技有限公司；SHZ-O（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；UV-6000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

紅曲總糖：精密稱定紅曲粉末1.00 g至100 mL圓底燒瓶，加入6 mol/L HCL溶液10 mL、蒸餾水15 mL，回流提取0.5 h，用碘化鉀-碘溶液檢查淀粉是否水解完全，水解完全后離心得提取液，提取液以酚酞做指示劑，利用10%的NaOH溶液中和，溶液變紅即為終點(diǎn)，定容至100 mL容量瓶，再取提取液1 mL稀釋定容至10 mL，得總糖供試品溶液。

紅曲還原糖：精密稱定紅曲粉末2.00 g至100 mL圓底燒瓶，加入15倍蒸餾水，90℃提取2 h，離心取上清液，濃縮至5 mL，定容至10 mL容量瓶，即得還原糖供試品溶液。

紅曲多糖供試溶液：按課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)[7]進(jìn)行制備。

紅曲淀粉：精密稱定紅曲粉末1.00 g，10 mL石油醚沖洗進(jìn)行脫脂，濾渣90℃干燥12 h，將干燥的粉末利用80%的乙醇10 mL，70℃水浴保溫進(jìn)行脫糖處理，棄濾液，重復(fù)2次，收集濾渣；濾渣用25 mL水沸水浴15 min，使淀粉糊化，放冷至60℃，加淀粉酶60℃水浴保溫水解1 h，碘液檢測(cè)淀粉是否水解完全，若是不顯藍(lán)色則水解完全，隨后煮沸將淀粉酶滅活。冷卻后離心過(guò)濾，濾液用水定容至100 mL容量瓶，取25 mL濾液至圓底燒瓶，加6 mol/L鹽酸2.5 mL水浴回流1 h，回流液以甲基紅做指示劑，利用20%NaOH溶液滴定中和，指示劑變黃為反應(yīng)終點(diǎn)，定容至50 mL容量瓶，得淀粉水解供試品溶液。

1.3.2 總糖和還原糖的含量測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

葡萄糖對(duì)照品溶液的制備：精密稱取干燥無(wú)水葡萄糖對(duì)照品100 mg，以水定容至100 mL容量瓶，搖勻，即得1.0 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置比色管，分別加水補(bǔ)至2.0 mL，再加入DNS溶液1.5 mL，混勻后沸水浴反應(yīng)5 min后，冷卻，以水定容至10 mL。以第一份為空白對(duì)照，紫外-可見(jiàn)分光光度法在540 nm處測(cè)定吸光度[8]。以葡萄糖的含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=1.128 5x-0.122 3，R2=0.997 3，葡萄糖含量線性范圍：0.3 mg～1.0 mg。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

1.3.2.2 DNS法顯色測(cè)定淀粉水解液、總糖、還原糖含量

精密量取紅曲淀粉水解液、總糖，還原糖供試品溶液1 mL至10 mL比色管中，補(bǔ)蒸餾水1 mL，加入DNS溶液1.5 mL，混勻，煮沸5 min，流水冷卻后用蒸餾水定容至10 mL。以水為空白同法顯色對(duì)照，在540 nm波長(zhǎng)下做紫外檢測(cè)。

圖1 DNS法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of glucose determination by DNS method

1.3.3 多糖含量測(cè)定方法

固態(tài)發(fā)酵紅曲中多糖的提取及含量測(cè)定按課題組前期發(fā)表文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 總淀粉含量測(cè)定方法

由于本實(shí)驗(yàn)利用的是國(guó)標(biāo)法進(jìn)行淀粉的含量測(cè)定，所以淀粉的水解液含量測(cè)定按照還原糖的測(cè)定方法來(lái)，同時(shí)量取50 mL水及與樣品處理時(shí)相同量的淀粉酶溶液，按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。最后在進(jìn)行折算。

式中：X為樣品中淀粉的含量，%；A1為測(cè)定用樣品中還原糖的含量，mg；A2為試劑空白中還原糖的含量，mg；0.9為還原糖（以葡萄糖計(jì)）換算成淀粉的換算系數(shù)；m1為稱取樣品質(zhì)量，g；V1為水解用樣品溶液體積，mL；V2為樣品定容總體積，mL；V3為測(cè)定用樣品處理液的體積，mL。

取不同時(shí)間點(diǎn)的固態(tài)發(fā)酵紅曲粉末，每一時(shí)間點(diǎn)取3份做平行試驗(yàn)，照“1.3.1”項(xiàng)下進(jìn)行紅曲總糖、還原糖提取，照“1.3.2”項(xiàng)進(jìn)行總糖和還原糖含量測(cè)定，多糖提取及含量測(cè)定方法依據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批紅曲粉末6份，樣品按照“1.3.1”項(xiàng)下供試品制備的方法同時(shí)制備6份總糖和還原糖供試品溶液照1.3.2.2項(xiàng)顯色后分別測(cè)定其吸光度A，結(jié)果RSD值分別為1.80%，2.11%。本方法重復(fù)性良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

分別取一份總糖和還原糖供試品溶液，照“1.3.2.2”項(xiàng)顯色后，連續(xù)測(cè)定其吸光度值6次。結(jié)果RSD值為1.39%和1.53%。證明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取一份總糖和還原糖供試品溶液，照“1.3.2.2”項(xiàng)顯色后，每隔10 min測(cè)定其吸光度。結(jié)果在1 h內(nèi)RSD值為1.16%和1.67%。表明供試品液顯色后在1 h內(nèi)吸光度值基本穩(wěn)定，而后呈下降趨勢(shì)。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn)

取同一時(shí)間批次樣品6份，依1.3.1項(xiàng)制備總糖和還原糖供試品溶液，測(cè)定供試品溶液糖含量。取已知含量的供試品溶液再加入相當(dāng)含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，照1.3.2.2項(xiàng)下顯色，得到測(cè)試液多糖含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、2。兩者回收率分別為2.25%和2.23%，符合標(biāo)準(zhǔn)。

表1 固態(tài)發(fā)酵紅曲總糖回收率測(cè)定結(jié)果Table 1 Sample recovery determination results of the total sugar of monascus

表2 固態(tài)發(fā)酵紅曲還原糖回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 Sample recovery determination results of reducing sugar of monascus

2.2 紅曲總糖含量動(dòng)態(tài)變化

紅曲總糖含量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖2。

圖2 固態(tài)發(fā)酵紅曲總糖含量變化Fig.2 The change of total sugar content in the solid fermentation of monascus

總糖的含量在第一天時(shí)高達(dá)76.77%，發(fā)酵初期平穩(wěn)，12 d以后隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，到達(dá)發(fā)酵第45 d，總糖含量維持在45%左右。

2.3 紅曲還原糖含量動(dòng)態(tài)變化

紅曲還原糖含量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖3。

圖3 固態(tài)發(fā)酵紅曲還原糖含量變化Fig.3 The change of reducing sugar content in the solid fermentation of monascus

還原糖含量在發(fā)酵初期僅有0.24%，隨后呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，發(fā)酵9 d時(shí)最高達(dá)1.47%，30 d以后趨于穩(wěn)定，保持在1.2%左右。

2.4 紅曲多糖的含量動(dòng)態(tài)變化

紅曲多糖的含量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4。

圖4 固態(tài)發(fā)酵紅曲多糖含量變化Fig.4 The change of Polysaccharidecontent in the solid fermentation of monascus

紅曲發(fā)酵初期多糖含量?jī)H為0.95%，且發(fā)酵初期保持在1.3%左右。12 d以后含量持續(xù)增長(zhǎng)，在30 d時(shí)達(dá)到最高6.14%，75 d以內(nèi)基本穩(wěn)定在5.5%左右，隨后呈下降趨勢(shì)。

2.5 紅曲淀粉的含量動(dòng)態(tài)變化

紅曲淀粉的含量動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖5。

紅曲中淀粉含量初期高達(dá)60.78%，隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，且初期下降快，后期下降慢，最后在發(fā)酵75 d停留在19.78%。

3 討論

本研究建立了固態(tài)發(fā)酵紅曲中總糖，還原糖和淀粉的含量測(cè)定方法，重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率等指標(biāo)結(jié)果較好。可以用于固態(tài)發(fā)酵紅曲總糖，還原糖和淀粉的含量測(cè)定。

圖5 固態(tài)發(fā)酵紅曲淀粉含量變化Fig.5 The change of starch in the solid fermentation of monascus

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅曲發(fā)酵初期總糖的含量較高，這與大米含大量淀粉有關(guān)[9]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，紅曲霉菌產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶等代謝物來(lái)水解淀粉以獲得碳源[10]，使淀粉和總糖含量在發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)下降，發(fā)酵天數(shù)增加到75 d后含量基本保持不變，可能與紅曲霉菌處于生長(zhǎng)平緩期或者代謝凋亡有關(guān)。

紅曲還原糖含量在發(fā)酵初期很低，1 d～9 d之內(nèi)含量呈直線上升趨勢(shì)，與紅曲霉菌產(chǎn)生大量酶系代謝還原糖使其含量急劇增加有關(guān)[11]。但在9d以后趨于平穩(wěn)，可能之后紅曲霉菌就不再代謝還原糖。

紅曲多糖在發(fā)酵初期增長(zhǎng)緩慢，可能是紅曲霉菌代謝初期產(chǎn)少量多糖，12 d以后呈快速上升趨勢(shì)，說(shuō)明霉菌在生長(zhǎng)旺盛期可產(chǎn)生大量多糖。30 d時(shí)含量達(dá)到最高6.14%，發(fā)酵后期30 d～75 d保持平穩(wěn)而后下降，可能是后期紅曲霉菌分解利用了其所產(chǎn)生的紅曲多糖所致[1]。

固態(tài)發(fā)酵紅曲相比于液體發(fā)酵紅曲具有產(chǎn)量高，處理簡(jiǎn)單，污染小等優(yōu)勢(shì)[11]，目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)紅曲多為固態(tài)發(fā)酵，紅曲中糖類物質(zhì)：淀粉，多糖，總糖，還原糖之前存在著密切的聯(lián)系，了解他們之間的物質(zhì)變化規(guī)律，有助于對(duì)紅曲發(fā)酵質(zhì)量進(jìn)行控制。本課題整體考察了紅曲發(fā)酵期間糖類成分的含量變化，有助于從整體觀察紅曲發(fā)酵情況，以期為紅曲發(fā)酵炮制機(jī)理和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供研究數(shù)據(jù)。

[1]蔣汶.紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)多糖及其性質(zhì)的初步研究[D],蕪湖:安徽工程大學(xué),2016

[2]李時(shí)珍.本草綱目[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005,1975:1547

[3]汪鵬榮,陳攀攀,藍(lán)麗精,等.紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵條件與抗氧化活性的研究[J],微生物學(xué)雜志,2011,31(4):19-23

[4]伍健萍.紅曲霉發(fā)酵多糖條件及抗氧化活性的初步研究[D].天津:天津科技大學(xué),2011

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].四部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.2015:326-327

[6]舒馨,劉雄民,梁秋霞,等.3-5二硝基水楊酸吸光光度法測(cè)定八角殘?jiān)锌偺?、還原糖含量[J].食品工業(yè)科技.2010,31(6):341-343

[7]羅佳,嚴(yán)敏嘉,李小芳,等.固態(tài)發(fā)酵紅曲中多糖含量測(cè)定方法的比較研究[J].食品研究與開發(fā)2017,38(3):130-133

[8]孫文,巢志茂,王淳,等.瓜蔞飲片中總糖及還原糖的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(9):96-99

[9]張美,楊登想,張叢蘭,等.不同品種大米營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定及主成分分析[J].食品科技,2014,39(8):147-152

[10]孫佰申.曲霉發(fā)酵及某些生理活性物質(zhì)的研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué),2004

[11]路秀玲,趙樹欣,劉忠華.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵中生物量的測(cè)定方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2001,06(1):45-49