幽門螺桿菌檢測方法的發(fā)展與比較

崔俊華， 李懿皞， 周佳燁， 吳 炯， 郭 瑋， 潘柏申

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種寄生于人胃黏膜的革蘭陰性螺桿菌，與許多胃腸道疾病如胃癌、胃潰瘍等有關(guān)。中國幽門螺桿菌科研協(xié)作組對我國Hp的感染率進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示我國Hp的總感染率高達(dá)56.22%[1]。自1983年Hp被發(fā)現(xiàn)以來，檢測該細(xì)菌的方法也不斷出現(xiàn)，但每種方法都存在著其各自的優(yōu)缺點和臨床應(yīng)用的限制。臨床常用的侵入性試驗包括內(nèi)鏡成像、組織學(xué)檢查、快速脲酶試驗、分離培養(yǎng)和以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為代表的分子生物學(xué)檢測；而非侵入性試驗則包括同位素標(biāo)記的尿素呼氣試驗（urea breath test，UBT）、糞便Hp抗原檢測（stool antigen test，SAT）、血清學(xué)試驗和分子生物學(xué)檢測。本文旨在對目前常用的臨床Hp感染檢測試驗進(jìn)行比較，并簡述它們各自的臨床應(yīng)用、可能存在的問題以及局限性。

1 侵入性試驗

內(nèi)鏡檢查是最常用的Hp診斷方法之一，常被用于Hp相關(guān)的消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃黏膜淋巴組織相關(guān)淋巴瘤等疾病的診斷。同時，內(nèi)鏡檢查也可為后續(xù)的其他侵入性試驗如快速脲酶試驗、組織學(xué)檢查、分離培養(yǎng)等獲取胃黏膜組織樣本。除了臨床常用的常規(guī)內(nèi)鏡外，還有酚紅染色內(nèi)鏡[2]、靛藍(lán)染色的放大內(nèi)鏡和激光共聚焦顯微內(nèi)鏡。

組織學(xué)檢查是首個被用于Hp感染檢測的試驗方法，通常被認(rèn)為是Hp感染直接檢查中的金標(biāo)準(zhǔn)，是最主要的檢驗方法之一。鏡下典型的細(xì)菌形態(tài)伴有炎癥的組織切片可以作為Hp感染的診斷指標(biāo)。影響組織學(xué)檢查診斷準(zhǔn)確性的因素包括取材的部位、樣本大小和數(shù)量、染色方法、質(zhì)子泵抑制劑（protonpump inhibitor，PPI）或抗菌藥物的運(yùn)用[3]、病理醫(yī)生的經(jīng)驗等。

肽核酸熒光原位雜交（peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization，PNA-FISH）是一種兼具高敏感性（97%）和高特異性（100%）的檢測技術(shù)，其快速、準(zhǔn)確、價格適宜，可檢測胃組織樣本中是否存在對克拉霉素耐藥的Hp[4]，還可檢測常規(guī)形態(tài)學(xué)檢查中易被漏檢的Hp球形體。

快速脲酶試驗具有廉價、快速、簡單、高特異性、原料獲取方便等優(yōu)點，是診斷Hp感染頗具實用性的侵入性試驗?？焖匐迕冈囼灥拿舾行院吞禺愋苑謩e達(dá)到了88%和89%[5]。一般來說，商業(yè)化的快速脲酶試驗通常有95%～100%的特異性和85%～95%的敏感性，而運(yùn)用化學(xué)發(fā)光酸堿指示劑可以得到比常規(guī)的快速脲酶試驗更快的結(jié)果和更高的敏感性。

2 分離培養(yǎng)

從胃組織活檢樣本中分離培養(yǎng)Hp是一種特異性很高（接近100%）的方法。常用于Hp分離培養(yǎng)的介質(zhì)包括：H.pylori agar、Skirrow agar、哥倫比亞血平板、布魯菌平板、腦心浸液平板等，需要在35～37 ℃微需氧環(huán)境中至少孵育5～7 d。而最近的研究表明，大氣等級的氧含量再加上10%左右的二氧化碳可促進(jìn)Hp的生長，隨后基于Hp形態(tài)學(xué)、脲酶陽性、過氧化物酶陽性、氧化酶陽性的特點進(jìn)行鑒別診斷[6]。但樣本狀況不合格、延遲運(yùn)送、暴露于氧氣環(huán)境、轉(zhuǎn)運(yùn)溫度改變或分離培養(yǎng)過程中操作不當(dāng)?shù)榷紩Ψ蛛x培養(yǎng)的結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，降低診斷的準(zhǔn)確性[7]。

盡管分離培養(yǎng)是一種昂貴、耗時的Hp診斷方法，但能進(jìn)行抗菌藥物的敏感性試驗使其在臨床應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢。在克拉霉素耐藥率＞20%的地區(qū)或在二線抗菌治療無效時就應(yīng)進(jìn)行Hp的分離培養(yǎng)和抗菌藥物體外敏感性試驗[3]。此外，分離培養(yǎng)可得到供后續(xù)表型和基因型特征分析試驗用的Hp單個菌株，從而能更好地理解其病理特征，為臨床治療提供依據(jù)。

3 非侵入性試驗

3.1 同位素標(biāo)記UBT

UBT在臨床上已經(jīng)應(yīng)用了接近30年，直至今日，仍是診斷Hp感染最常用的非侵入性試驗，并用于Hp流行病學(xué)調(diào)查和根除治療的療效評估[3]。在一項UBT的Meta分析中，其敏感性和特異性分別為96%和93%[8]。目前，臨床常用的13C-UBT和14C-UBT在診斷準(zhǔn)確性上并無差異[9]。為避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，患者需要在試驗前2 周停用PPI或在試驗前4周停用抗菌藥物[3]；患者的出血癥狀會造成UBT的假陰性結(jié)果，而胃中其他產(chǎn)尿素酶的病原體的存在也會導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。UBT對于胃部分切除的Hp患者診斷不佳的原因可能是尿素沒能充分與尿素酶發(fā)生反應(yīng)[10]。一種快速持續(xù)的實時UBT-Breath ID可能可以克服這種缺點，有研究顯示其準(zhǔn)確性達(dá)到87%，高于UBT（72%）[11]。

3.2 SAT

SAT是另一種對于Hp診斷有著很高敏感性和特異性的非侵入性試驗。在一項全球性的Meta分析中，其敏感性和特異性分別為94%和97%[12]。選用單克隆抗體的試驗方法相比多克隆抗體的準(zhǔn)確性更高，而酶免疫法的結(jié)果比免疫層析法更為可靠。SAT結(jié)果的準(zhǔn)確性受多種因素，如抗菌藥物、氫離子泵抑制劑、N-乙酰半胱氨酸、排便和上消化道出血的影響[3]。而樣本的保存，如溫度、運(yùn)送時間和臨界值的選擇也對SAT診斷的準(zhǔn)確性有影響[13]。近來研發(fā)的Atlas Hp抗原檢測是一種全新的單克隆免疫層析SAT，相比之前的單克隆免疫層析SAT有著更優(yōu)秀的診斷性能（敏感性91.7%、特異性100.0%、準(zhǔn)確性96.6%）[14]。另一項采用SAT檢測胃遠(yuǎn)端胃癌切除患者糞便Hp抗原的小型研究顯示，SAT的檢測敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為100.0%、90.5%和96.6%[15]。

3.3 抗體相關(guān)檢測

有無數(shù)基于抗Hp IgG抗體的血清學(xué)試驗被用于Hp感染的診斷，由于其具有廉價、快速、易于被患者接受的特點而被廣泛用于流行病學(xué)的調(diào)查。血清學(xué)試驗的準(zhǔn)確性依賴于試劑選用的抗原以及作為抗原的特定Hp菌株的流行率，所以應(yīng)選用當(dāng)?shù)亓餍芯昊虿煌M菌株匯總抗原譜，同時血清學(xué)試驗的臨界值也應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r來設(shè)置。不同的血清學(xué)試驗存在明顯的差異，酶免疫試驗中的敏感性為57.8%～100.0%，特異性為58.7%～96.8%；免疫層析試驗的敏感性為55.6%～97.8%，特異性為60.3%～96.8%[16]。

血清學(xué)試驗在毒力因子和病原學(xué)的研究中也起到了重要的作用。胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）Ⅰ、PGⅡ和PGⅠ/PGⅡ比值三者結(jié)合抗Hp抗體的檢測已被廣泛用于預(yù)測萎縮性胃炎和胃癌的風(fēng)險[17]。Hp感染患者血清中存在的抗細(xì)胞毒素相關(guān)抗原A（cytotoxinassociated antigen A，CagA）抗體、抗空泡細(xì)胞毒素（vacuolating cytotoxin A，VacA）抗體和抗熱休克蛋白60抗體可作為感染高危險性菌株的血清標(biāo)志物。一項Meta分析顯示，CagA抗體檢測用來診斷胃癌的綜合敏感性和特異性分別為71%和40%，診斷優(yōu)勢比為2.11[18]。

血清學(xué)試驗的其他優(yōu)點包括診斷準(zhǔn)確性不受潰瘍出血、胃萎縮和抗菌藥物或PPI使用的影響，這些因素在其他的侵入性或非侵入性試驗中會導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，但其仍不能被作為Hp感染的首選診斷試驗[19]。血清學(xué)試驗由于其抗體效價在根治成功后仍能維持很長時間，故不能用于評估根治療法的療效，也不能區(qū)分Hp的近期感染和既往感染[3]。

4 PCR

PCR被廣泛地用于檢測來自胃組織、糞便、胃分泌物以及其他樣本中的Hp。相比其他常規(guī)的檢測方法，PCR擁有著超過95%的特異性和敏感性，并在檢測消化道出血患者的Hp時能得出更準(zhǔn)確的結(jié)果。用于檢測Hp的目的基因包括ure A、glmM、ure C、16S rRNA、23S rRNA、HSP60和VacA等。2個不同的保守目的基因的聯(lián)合運(yùn)用可避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，尤其是非胃組織來源的臨床樣本，從而提高了檢測的特異性。PCR的其他優(yōu)點包括樣本中需要的原始菌量少、檢測快速、無需特殊處理或轉(zhuǎn)運(yùn)流程，能幫助臨床醫(yī)生在診療時作出更快、更準(zhǔn)確的判斷。此外，PCR也能同時對特定位點的耐藥基因[大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物（cagA、νacA）[20]、克拉霉素（23S rRNA）、喹諾酮類藥物（gyrA）、四環(huán)素（16S rRNA）、利福平（rpoB）、阿莫西林（pbp-1a）和甲硝噠唑（rdxA、frxA、frxA）[21]等]的突變進(jìn)行檢測。在一項運(yùn)用實時PCR檢測Hp感染和克拉霉素耐藥的研究中，學(xué)者認(rèn)為定義至少5個可能改變的位點對于提升耐藥性監(jiān)測的準(zhǔn)確性極為重要[22]。

實時PCR現(xiàn)在常常被用于定量分析組織樣本中Hp的DNA含量，但實時PCR的開展需要昂貴的熱循環(huán)儀，對于很多臨床實驗室來說這依舊是個難題。目前已研發(fā)出了一種基于雙啟動寡核苷酸（dual-priming oligonucleotide，DPO）的多重PCR來同時檢測Hp感染及其對克拉霉素的耐藥性，這項試驗可以在任何的常規(guī)熱循環(huán)儀上進(jìn)行，其成本低于實時PCR。

CHUNG等[23]采用已進(jìn)行過快速脲酶試驗的組織樣本評估DPO-PCR的診斷準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示DPO-PCR相比快速脲酶試驗和組織學(xué)檢查有著更高的敏感性，同時DPO-PCR也可以檢測出那些快速脲酶試驗陰性樣本中的Hp，胃組織樣本的DPO-PCR與快速脲酶試驗檢測結(jié)果的一致率達(dá)到94.4%。

有學(xué)者建立了一種高通量多基因檢測Hp（high-throughput multiplex genetic detection system，HMGS）[24]，可以使用胃組織樣本直接檢測Hp并且能檢出多種Hp的混合感染，同時還能進(jìn)行Hp毒力基因（cagA、dupA、luxS、νacA s1、oipA、νacA m1等）和多種耐藥基因（pbp1A、23S rRNA、gyrA、rdxA等）的檢測。相比組織培養(yǎng)和快速脲酶試驗，HMGS有著很高的特異性（97.1%）、敏感性（93.7%）和準(zhǔn)確性（95.5%）[25]。

對毒力因子進(jìn)行PCR檢測有助于評估Hp毒力因子的基因多態(tài)性，同時也給我們帶來更多的信息以理解感染不同Hp菌株患者的臨床差異。毒力因子基因如cagA和νacA，與許多劇烈的胃部炎癥及高發(fā)病率的消化性潰瘍、胃癌有關(guān)。一種新設(shè)計的配有特異性引物（基于整個221位dupA基因序列）的實時PCR將dupA基因的檢測率提高到了64.2%，而常規(guī)PCR的檢測率只有29.9%～37.8%[26]。這篇文章的作者指出，PCR的設(shè)計方案對于檢測毒力因子有很重大的影響。

運(yùn)用PCR檢測糞便中的Hp是可靠、方便的方法，尤其對于兒童來說。糞便PCR也有著能鑒別特定基因型以及對抗菌藥物耐藥性的優(yōu)點。口腔被認(rèn)為是Hp在胃以外的重要聚集地，但口腔中Hp作為再感染或傳播途徑的意義仍舊不明。唾液和牙斑是口腔中Hp檢測常用的樣本。快速脲酶試驗和分離培養(yǎng)的方法常常在早期的研究中被用于檢測口腔Hp，而PCR是近期試驗中最為常用和可靠的方法?？谇籋p檢測的分布有著很大的差異，從0%到100%不等，同時也有唾液中陰性而牙斑中陽性的情況?？谇恢蠬p分布的巨大差異可能與不同研究方法、不同人群和不同引物的使用有關(guān)。近期的研究重點主要為引物的修改對于提高診斷準(zhǔn)確性的作用。一種采用了基于48種Hp菌株全基因組中共有的高度保守序列的Hp特異性引物的新PCR系統(tǒng)近日已被研發(fā)出來，可以提升口腔PCR的診斷準(zhǔn)確性。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新的具有高度特異性和敏感性的DNA擴(kuò)增法。AMIRI等[27]的研究結(jié)果顯示，LAMP有著比PCR更高的Hp檢出率，LAMP和PCR對牙斑樣本中Hp的檢出率分別為66.7%和44.0%。

PCR對流行病學(xué)調(diào)查中環(huán)境樣本Hp的檢測也有著很大的幫助。運(yùn)用PCR檢測出的飲用水樣本中高含量的Hp能提供更多通過飲用水傳播的Hp信息。在未洗凈的蔬菜上污染Hp的高檢出率也提示了洗凈蔬菜能減少Hp的污染。

PCR比快速脲酶試驗、組織學(xué)檢查和分離培養(yǎng)有著更高的敏感性，其敏感性分別為91%、66%、43%和37%，與血清學(xué)檢查、UBT的敏感性（均為94%）相當(dāng)，在消化性潰瘍出血患者的Hp檢查中PCR與UBT的檢測準(zhǔn)確性相當(dāng)。但PCR的特異性（100%）僅明顯優(yōu)于血清學(xué)試驗（65%），與其他試驗并無太大區(qū)別（快速脲酶試驗95%、組織學(xué)檢查95%、分離培養(yǎng)100%、UBT 85%）[28]。巢式PCR檢測根治療法后胃組織活檢樣本中Hp比快速脲酶試驗、組織學(xué)檢查、分離培養(yǎng)有著更好的敏感性。此外基于PCR的方法能更好地分辨根治治療后的再復(fù)發(fā)和二次感染。

雖然PCR能更快速、更精確地檢測Hp及其耐藥菌株，但成本、試驗設(shè)備等都影響著PCR在臨床的應(yīng)用。

5 總結(jié)

現(xiàn)有診斷技術(shù)的發(fā)展讓我們能更準(zhǔn)確地診斷Hp感染，同時也讓我們對與Hp相關(guān)的疾病處理得更好。比較臨床常用的方法，血清學(xué)試驗、UBT、SAT、快速脲酶試驗、組織學(xué)檢查、PCR和分離培養(yǎng)的敏感性、特異性分別為85%和79%、75%～100%和77%～100%、67%～100%和61%～100%、75%～100%和84%～100%、66%～100%和94%～100%、75%～100%和84%～100%以及55%～56%和100%（圖1），而PCR的檢測敏感性可以通過改用巢式或半巢式PCR來提升[29]。目前尚無檢測Hp的金標(biāo)準(zhǔn)方法，選擇Hp感染的檢測方法取決于當(dāng)?shù)亓餍械腍p、每種方法的優(yōu)缺點與可操作性以及每例患者獨特的臨床狀況。結(jié)合2種或2種以上檢測方法以獲取最可靠的結(jié)果在常規(guī)的臨床操作中是個不錯的選擇。我們相信，在未來，我們會針對不同的臨床目的、特定的人群和不同的基因型特征持續(xù)改進(jìn)Hp的檢測方法，從而使Hp感染的診斷更為可靠，診斷模式更為合理[30]。

圖1 不同Hp診斷試驗的敏感性與特異性的對比

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