ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)嗜鉻蛋白A的性能評(píng)價(jià)及臨床應(yīng)用

胡玉懿， 吳 蕙， 韓 序， 張春燕， 郭 瑋， 樓文暉， 潘柏申

（1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032）

嗜鉻蛋白A（chromogranin A，CgA）屬于嗜鉻蛋白家族，存在于所有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)能分泌兒茶酚胺的囊泡中[1]，是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為48 000的酸性、親水性、可溶性蛋白質(zhì)，最初在腎上腺嗜鉻顆粒中，其與兒茶酚胺及鈣等是共分泌的[2]。在CgA上有很多堿性氨基酸對(duì)，是潛在的激素原轉(zhuǎn)化酶切位點(diǎn)，且很多酶切產(chǎn)物已被鑒定，其中有些產(chǎn)物具有生物學(xué)功能。近年來(lái)有很多研究表明，在多種病理、生理狀態(tài)下，CgA及其衍生片段在組織中含量升高，發(fā)揮抑制性生理功能或作為疾病診斷的標(biāo)志物[3]。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的腫瘤。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有神經(jīng)內(nèi)分泌表型，可以產(chǎn)生多種激素的一大類細(xì)胞。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞遍布全身各處，因此神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤可以發(fā)生在體內(nèi)任何部位，但胃、腸、胰腺等消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤最常見(jiàn)，約占所有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的2/3[4]。國(guó)外有研究結(jié)果顯示，幾乎所有類型的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者都會(huì)有血漿或血清CgA水平的升高[5]，因此在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷中，CgA是極具有診斷價(jià)值的非特異性腫瘤標(biāo)志物[4，6-8]。本研究對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）雙抗體夾心法檢測(cè)CgA進(jìn)行性能驗(yàn)證，并對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年10月—2015年6月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床病理診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的患者66例作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組，其中胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤39例、胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤10例、腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤15例、肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤2例。其病理診斷結(jié)果均經(jīng)2名病理科醫(yī)師確認(rèn)。66例患者中男25例、女41例，年齡（55.62±11.57）歲。以在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院進(jìn)行體檢的41名健康者為健康對(duì)照組，其中男18名、女23名，年齡（43.29±18.69）歲。選取2013年3月—2015年3月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床診斷為胰腺腫瘤、胰腺腫物的患者65例作為疾病對(duì)照組，其中男31例、女34例，年齡（54.49±12.36）歲。

1.2 試劑

采用法國(guó)Cisbio Bioassays公司的ELISA試劑盒手工檢測(cè)CgA，試劑批號(hào)為41X和43D。

1.3 檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

1.3.1 精密度的驗(yàn)證 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） EP15-A文件[9]，將3個(gè)水平混合樣本（S1、S2、S3）分別重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算批內(nèi)均值和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）；將3個(gè)水平混合樣本每日檢測(cè)2個(gè)批次，每批次各檢測(cè)2次，連續(xù)檢測(cè)5 d，計(jì)算批間均值和CV。

1.3.2 正確度的驗(yàn)證 測(cè)定賦值質(zhì)控品，計(jì)算測(cè)定均值與質(zhì)控品標(biāo)示濃度的相對(duì)偏移。

1.3.3 線性范圍的驗(yàn)證 將已確定低值和高值的樣本按照一定比例混合稀釋，配制成5個(gè)等差濃度比例的樣本（4L、3L+H、2L+2H、L+3H、4H），“L”為低值樣本，“H”為高值樣本。按濃度由低到高檢測(cè)2次，計(jì)算均值。以實(shí)際均值為Y、理論值為X，擬合一次（Y=aX+b）、二次（Y=aX2+bX+c）、三次（Y=aX3+bX2+cX+d）多項(xiàng)式方程，并參考CLSI EP6-A文件[10]，評(píng)估是否為線性。

1.3.4 定量檢測(cè)下限的評(píng)價(jià) 參考CLSI EP17-A文件[11]，選擇1份接近廠家聲明的檢測(cè)限（7.00 ng/mL）的低水平健康者樣本（7.93 ng/mL），測(cè)定20次，至少有18次檢出為符合要求。

1.4 臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

比較神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組、健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組血清CgA水平的差異。通過(guò)繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）來(lái)評(píng)估CgA對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的診斷能力，獲得最佳診斷界值和此時(shí)的診斷敏感性、特異性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的連續(xù)計(jì)量資料采用x±s表示。偏態(tài)分布資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]描述，多組之間比較采用Kruskall-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度的驗(yàn)證

ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)血清CgA的批內(nèi)CV＜14.00%、批間CV＜8.00%，均近似廠家提供的CV。見(jiàn)表1。

2.2 正確度的驗(yàn)證

質(zhì)控品測(cè)定值為（80.47±4.13）ng/mL，質(zhì)控品標(biāo)示濃度為（77.0±11.6）ng/mL，相對(duì)偏移為4.51%。

表1 CgA檢測(cè)的批內(nèi)、批間精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 線性范圍的驗(yàn)證

一次多項(xiàng)式擬合方程為Y=0.793X-3.791，r2=0.988。二次多項(xiàng)式系數(shù)a的P值＞0.05，三次多項(xiàng)式系數(shù)a的P值＞0.05，b的P值＞0.05。顯示二次、三次多項(xiàng)式系數(shù)與“0”無(wú)明顯差異，說(shuō)明曲線在8～740 ng/mL范圍內(nèi)呈線性。

2.4 定量檢測(cè)下限的評(píng)價(jià)

CgA的檢測(cè)下限為7.93 ng/mL，檢測(cè)20次，全部檢出，且濃度接近試劑說(shuō)明書(shū)提供的檢測(cè)限（7.00 ng/mL），符合檢測(cè)下限要求。

2.5 神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組、健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組之間血清CgA水平的比較

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組、健康對(duì)照組、疾病對(duì)照組血清CgA水平分別為71.48（47.79，160.22）、40.85（28.70，62.92）和51.60（33.63，90.37） ng/mL，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），且兩兩之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者一般特征和血清CgA水平的比較

圖1 3組之間血清CgA水平的比較

2.6 血清CgA對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的診斷價(jià)值分析

ROC曲線分析顯示，血清CgA鑒別正常人和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的AUC為0.741。以敏感性與特異性之和最大時(shí)的值為最佳診斷界值，血清CgA在最佳診斷界值為47.18 ng/mL時(shí)的診斷敏感性為78.8%，特異性為68.3%。見(jiàn)圖2。

圖2 CgA鑒別正常人和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的ROC曲線

3 討論

CgA存在于多種動(dòng)物的內(nèi)分泌組織和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的嗜鉻顆粒中，由439個(gè)氨基酸組成，成熟的CgA被糖基化、硫酸化修飾，是一種酸性糖蛋白，等電點(diǎn)在5.0左右。CgA具有不同的蛋白酶水解位點(diǎn)，在不同內(nèi)分泌組織中被水解為具有不同抑制作用的活性片段，參與激素的調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)明確，CgA是國(guó)際公認(rèn)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的非特異性指標(biāo)，可以輔助診斷神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，由于其存在于絕大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中并釋放入血循環(huán)，所以神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的CgA水平會(huì)有大幅度升高[12-16]。

檢測(cè)CgA的方法包括放射免疫法和ELISA。本實(shí)驗(yàn)室采用國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道較多的Cisbio Bioassays公司的ELISA試劑盒進(jìn)行手工檢測(cè)，參考CLSI文件進(jìn)行部分調(diào)整后對(duì)CgA的精密度、正確度、線性范圍和定量檢測(cè)下限的分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，該方法精密度良好（批內(nèi)CV＜14.00%、批間CV＜8.00%），都近似于廠家提供的CV；在正確度驗(yàn)證中，質(zhì)控品實(shí)測(cè)濃度皆在質(zhì)控品標(biāo)示濃度范圍內(nèi)，實(shí)測(cè)均值與靶值的偏移＜5.00%；該方法的線性范圍是8～740 ng/mL；定量檢測(cè)下限（7.93 ng/mL）也接近廠家提供的性能參數(shù)，符合臨床檢測(cè)要求。

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是起源于彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一組異質(zhì)性腫瘤群，可發(fā)生在身體各個(gè)部位。目前，多數(shù)學(xué)者都不認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一種罕見(jiàn)疾病。亦有文獻(xiàn)指出，在胃腸道腫瘤中，神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)病率僅次于結(jié)直腸癌，比胃癌、胰腺癌、食管癌以及肝膽癌更常見(jiàn)[14]。有多篇文獻(xiàn)曾報(bào)道，血清CgA被認(rèn)為是包括美國(guó)在內(nèi)的部分西方國(guó)家診斷胃腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的有用標(biāo)志物[4，17-18]，而在亞洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤人群中也得到類似的結(jié)論[19-22]。并且，CgA水平的異常升高是推斷神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤為局灶性還是已發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)，經(jīng)手術(shù)治療的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者，血清CgA水平則相應(yīng)降低[23]。因此，血清CgA不僅是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤輔助診斷的標(biāo)志物，還可以作為腫瘤治療過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和判斷預(yù)后的指標(biāo)。亦有報(bào)道證明，在嗜鉻細(xì)胞瘤和功能性良性腫瘤上，CgA的敏感性比24 h尿5-羥基吲哚乙酸更高[24]。

本研究結(jié)果顯示神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者血清CgA水平明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.001 0），神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者和疾病對(duì)照組的血清CgA水平也有差異（P=0.014 5），提示CgA可以為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷提供幫助。

ROC曲線分析顯示，血清CgA鑒別正常人和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的最佳診斷界值為47.18 ng/ mL，診斷敏感性為78.8%，特異性為68.3%。

綜上所述，ELISA雙抗體夾心法定量檢測(cè)CgA的各項(xiàng)檢測(cè)性能均符合臨床要求。對(duì)CgA初步臨床應(yīng)用的研究顯示，血清CgA是診斷神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的有用標(biāo)志物，CgA水平在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者中顯著升高，可以為臨床提供有用的診斷參考。但本研究未分析CgA對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的預(yù)后作用，這也是之后研究的方向。

[1]MODLIN I M，GUSTAFSSON B I，MOSS S F，et al. Chromogranin A-biological function and clinical utility in neuro endocrine tumor disease[J]. Ann Surg Oncol，2010，17（9）： 2427-2443.

[2] TAUPENOT L， HARPER K L，O'CONNOR D T.The chromogranin-secretogranin family[J]. N Engl J Med，2003， 348（12）：1134-1149.

[3]HELLE K B. Chromogranins：universal proteins in secretory organelles from paramecium to man[J].Neurochem Int， 1990，17（2）：165-175.

[4]ERIKSSON B，OBERG K， STRIDSBERG M. Tumor markers in neuroendocrine tumors[J].Digestion， 2000，62（Suppl 1）：33-38.

[5]YAO J C，HASSAN M，PHAN A，et al. One hundred years after “carcinoid”：epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35 825 cases in the United States[J]. J Clin Oncol，2008，26（18）： 3063-3072.

[6]VINIK A I，WOLTERING E A，WARNER R R，et al. NANETS consensus guidelines for the diagnosis of neuroendocrine tumor[J]. Pancreas，2010， 39（6）：713-734.

[7]LAWRENCE B， GUSTAFSSON B I， KIDD M，et al. The clinical relevance of chromogranin A as a biomarker for gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors[J]. Endocrinol Metab Clin North Am，2011， 40（1）： 111-134.

[8]CAMPANA D， NORI F， PISCITELLI L ，et al. Chromogranin A：is it a useful marker of neuroendocrine tumors?[J]. J Clin Oncol，2007， 25（15）： 1967-1973.

[9]National Committee for Clinical Laboratory Standards.User demonstration of performance for precision and accuracy[S]. EP15-A，NCCLS，2001．

[10]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures：a statistical approach[S]. EP6-A，NCCLS，2003．

[11]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation[S]. EP17-A，NCCLS，2004．

[12]NIKOU G C，MARINOU K，THOMAKOS P，et al. Chromogranin a levels in diagnosis， treatment and follow-up of 42 patients with non-functioning pancreatic endocrine tumours[J]. Pancreatology，2008，8（4-5）：510-519.

[13]楊曉鷗，李景南，錢家鳴，等. 血漿嗜鉻粒蛋白A對(duì)多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷價(jià)值[J]．中華內(nèi)科雜志，2011，50（2）：124-127．

[14]N?LTING S，KUTTNER A，LAUSEKER M，et a1．Chromogranin a as serum marker for gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors：a single center experience and literature review[J].Cancers（Basel），2012，4（1）：141-155．

[15]WALTER T，CHARDON L，CHOPIN-LALY X，et a1．Is the combination of chromogranin A and pancreatic polypeptide serum determinations of interest in the diagnosis and follow-up of gastroentero-pancreatic neuroendocrine tumours[J]．Eur J Cancer，2012，48（12）：1766-1773．

[16]葉必星，林琳. 嗜鉻素A和突觸素對(duì)胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷及預(yù)后的臨床價(jià)值[J]．中華消化雜志，2012，32（1）：29-32．

[17]王鈺虹，林原，薛玲，等. 血清嗜鉻素A在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤臨床診斷和診療評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中華消化雜志，2013，33（8）：532-537.

[18]OBERG K. Neuroendocrine tumors（NETs）：historical overview and epidemiology[J]. Tumori，2010，96（5）： 797-801.

[19]O'TOOLE D，GROSSMAN A ，GROSS D，et al.ENETS consensus guidelines for the standards of care in neuroendocrine tumors：biochemical markers[J].Neuroendocrinology， 2009， 90（2）：194-202.

[20]FEROLLA P，F(xiàn)AGGIANO A，MANSUETO G，et a1.The biological characterization of neuroendocrine tumors：the role of neuroendocrine markers[J]. J Endocrinol Invest，2008，31（3）：277-286．

[21]ITO T， OKUSAKA T， IKEDA M，et al.Everolimus for advanced pancreatic neuroendocrine tumours： a subgroup analysis evaluating Japanese patients in the RADIANT-3 trial[J]. Jpn J Clin Oncol，2012， 42（10）：903-911.

[22]ITO T， OKUSAKA T， NISHIDA T，et al.Phase Ⅱ study of sunitinib in Japanese patients with unresectable or metastatic， well-differentiated pancreatic neuroendocrine tumor[J]. Invest New Drugs，2013，31（5）：1265-1274.

[23]徐建明，楊晨．胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤國(guó)際診斷共識(shí)的解讀[J]．臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16（11）：1033-1038．

[24]中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤專家委員會(huì). 中國(guó)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤專家共識(shí)（2016年版）[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志，2016，21（10）：927-946.