HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b抗體MAIPA定量檢測方法的建立

李睿書， 凌 冰， 陸 萍

（上海市血液中心 上海市輸血研究所，上海 200051）

作為國際輸血學(xué)會（the International Society of Blood Transfusion，ISBT）推薦的檢測人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，單克隆抗體特異性免疫固定檢測（monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen，MAIPA）法具有很高的敏感性和特異性，其重要特點之一是血小板（platelet，PLT）表面抗原在與血清中的抗體、特定抗人PLT膜糖蛋白單抗結(jié)合的過程中，仍然保持著天然的構(gòu)象。另外，MAIPA還可用于PLT的分型。然而，國內(nèi)雖然有使用MAIPA進(jìn)行PLT抗體檢測的臨床應(yīng)用[1-3]，但成熟穩(wěn)定的MAIPA定量檢測方法尚未建立。在引發(fā)新生兒同種免疫性血小板減少癥的HPA抗體中，HPA-1a、HPA-5b和HPA-3a的抗體相對較為常見[4-5]。為此，本研究初步建立了針對HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗體的MAIPA定量檢測方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

采用G&T SSP Typer基因分型試劑盒（美國G&T Biotech公司，批號W9902、B9811A）對重復(fù)獻(xiàn)血者進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和HPA基因分型，建立上海市單采PLT供者資料庫。O型HPA-1a/a、HPA-3a/a、HPA-5a/b的新鮮單采PLT來自資料庫篩選的特定血型的獻(xiàn)血者，采集于上海市血液中心。HPA-1a標(biāo)準(zhǔn)抗血清、HPA-3a參比抗血清、HPA-5b參比抗血清購自英國國家生物制品檢定所，貨號分別為03/152、03/190、99/666；小鼠抗人CD61單克隆抗體購自美國BD公司，貨號為555752；小鼠抗人CD41和CD49b單克隆抗體購自美國R&D公司，貨號分別為MAB7616和MAB1233；羊抗鼠IgG單抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗人IgG均購自美國Jackson公司，貨號分別是115-005-071、109-035-098；包板液、HRP底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺和終止液均購自美國SurModics公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 酶標(biāo)板包被 用包被液稀釋羊抗鼠IgG至3 μg/mL，平底酶標(biāo)板每孔加入100 μL，4 ℃靜置過夜，Tris鹽緩沖液（Tris 1.21 g、NaCl 8.5 g、CaCl20.055 g、NP40 5 mL、Tween 0.5 mL，定容至1 L）洗滌3次并浸泡30 min封閉。

1.2.2 PLT準(zhǔn)備 單采PLT用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）/乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；含EDTA- Na23.35 g、Na2HPO4·12H2O 7.52 g、NaCl 8.18 g，pH值調(diào)至7.0，定容至1 L）溶液洗滌，1 455×g離心 5 min，棄上清，重復(fù)2次。PLT洗滌完畢后重新懸浮于PBS/EDTA中，用血液分析儀將終濃度調(diào)整至200×109/L。

1.2.3 MAIPA定量檢測方法的建立 在U形底微孔板中每孔加入100 μL PLT懸液，1 455×g離心3 min，棄上清，在吸水紙上輕輕拍干。根據(jù)實驗設(shè)計，在各孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清或待測血清樣品50 μL，將PLT輕輕吹打均勻，37 ℃孵育30 min。用PBS/EDTA洗滌2次，每次1 455×g離心3 min，棄上清，在吸水紙上輕輕拍干。各孔加入合適濃度的鼠抗人相應(yīng)PLT糖膜蛋白單抗40 μL（稀釋液為0.1%牛血清白蛋白-PBS），將PLT輕輕吹打均勻，37 ℃孵育30 min。用PBS/EDTA洗滌3次，每次1 455×g離心3 min，棄上清，在吸水紙上輕輕拍干。每孔加入130 μL裂解液（Tris 0.6 g、NaCl 4.25 g、NP40 2.5 mL，pH值調(diào)至7.4，定容至0.5 L），將PLT吹打懸浮，室溫裂解15 min。4 ℃ 3 724×g離心15 min，每孔吸取上清100 μL至封閉好的平底酶標(biāo)板中，4 ℃反應(yīng)2 h。TBS洗滌液洗滌3次，每孔加入合適濃度的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG（稀釋液為0.1%牛血清白蛋白-PBS），37 ℃孵育30 min。TBS洗滌液洗滌3次，每孔加入3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺，室溫顯色30 min，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度（A）值。

1.2.4 方法學(xué)評價 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線：HPA-1a標(biāo)準(zhǔn)抗血清（03/152）的原始濃度為100 UI，HPA-3a抗血清（03/190）和HPA-5b抗血清（99/666）的原始濃度均為100 AU，分別配制不同濃度的HPA-1a抗血清（0、1、2、3、4 IU）、HPA-3a抗血清（0、1、2、4、8、12、16、20 AU）和HPA-5b抗血清（0、2、4、8、12、16、20 AU），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性擬合。（2）敏感性試驗：分別對上述3種抗血清零標(biāo)準(zhǔn)品測定20次，以檢測值的x +3s作為方法的敏感性，計算方法為將算得的x +3s值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的相應(yīng)抗體濃度即為敏感性。（3）特異性試驗：用3種抗體的MAIPA定量檢測法分別對以上3份抗血清（03/152、03/190、99/666）和人源抗體抗A、抗B、抗I、抗P（滴度＞1∶64，10倍稀釋）進(jìn)行測定，根據(jù)方法的敏感性判斷其陰、陽性。（4）準(zhǔn)確性和精密度試驗：針對方法檢測HPA-1、HPA-3a、HPA-5b抗體的MAIPA方法，分別選擇對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抗血清或參比抗血清線性范圍內(nèi)的3個不同濃度，批內(nèi)測定12次，批間測定7次，分別計算其平均回收率和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

表1 HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗體MAIPA定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系經(jīng)優(yōu)化后的實驗條件

2 結(jié)果

HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b抗體MAIPA定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系經(jīng)過優(yōu)化的實驗條件見表1。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

HPA-1a、HPA-3a和HPA-5b 3種抗體的MAIPA定量檢測方法的檢測范圍分別為0～4 IU、0～20 AU、0～20 AU，標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測范圍內(nèi)具有良好的線性擬合度（R2＞ 0.99）。見圖1。

2.2 敏感性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3種抗體的MAIPA定量檢測方法的敏感性分別為0.3 IU、1.0 AU和1.5 AU。見表2。

2.3 特異性

圖1 HPA-1a、 HPA-3a和HPA-5b 3種抗體MAIPA定量檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3種抗體MAIPA定量檢測方法的敏感性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3種抗體的MAIPA定量檢測方法檢測不同HPA抗血清（03/152、03/190、99/666）均為陽性，而檢測人源抗體抗A、抗B、抗I、抗P均無明顯陽性。方法具有良好的特異性。見圖2。

2.4 準(zhǔn)確性和精密度

圖2 MAIPA定量檢測方法的特異性

HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3種抗體的MAIPA定量檢測方法的準(zhǔn)確性（回收率）為96.20%～103.10%、97.90%～103.10%、100.20%～106.10%，批內(nèi)精密度（CV）分別為1.3%～3.6%、2.7%～5.2%和4.7%～5.3%，批間精密度（CV）分別為4.0%～5.6%、4.4%～5.9%和3.2%～6.3%。見表3。

表3 HPA-1a、HPA-3a、HPA-5b 3種抗體MAIPA定量檢測方法的準(zhǔn)確性和精密性

3 討論

人類PLT抗原是分布在PLT膜糖蛋白上的一類具有型特異性的抗原，在臨床上具有特定意義。在輸血或妊娠過程中，由于HPA血型不合而產(chǎn)生的同種抗體可引發(fā)多種同種免疫疾病。在臨床輸注PLT時，如果患者血清中檢測出PLT抗體，則應(yīng)該針對抗體的特異性，采用相應(yīng)抗原陰性的供體PLT進(jìn)行輸注，否則可能引起嚴(yán)重的輸血反應(yīng)。

目前，HPA抗體檢測的方法較多，各有優(yōu)缺點。MAIPA作為ISBT推薦的檢測HPA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，在眾多方法中有著特殊的地位。MAIPA最大的優(yōu)點是能檢測出HPA抗體的特異性，因為PLT糖蛋白與待測血清以及對應(yīng)鼠源單抗反應(yīng)時能保持天然構(gòu)象，其抗原性沒有受到任何破壞。因此，MAIPA也成為ISBT PLT免疫學(xué)研討會質(zhì)控項目的指定檢測方法。盡管已經(jīng)成為金標(biāo)準(zhǔn)，國外也有一些對于MAIPA實驗方法建立和改良的報道[6-10]，并且將其應(yīng)用于免疫性PLT減少癥的臨床分析和診斷[11-16]。然而，成熟穩(wěn)定的MAIPA標(biāo)準(zhǔn)定量檢測方法尚未形成。

在建立本方法的實驗過程中，本研究對多個步驟的反應(yīng)條件進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化，通過單因素變量分析，同時將實驗成本作為考慮因素之一，確定了各步驟的最優(yōu)條件。預(yù)試驗結(jié)果顯示，當(dāng)HPA-1a標(biāo)準(zhǔn)抗血清濃度超過4 IU時，A450nm值隨抗體濃度升高而增加的趨勢趨于緩慢，并且逐漸接近平臺，因此本研究認(rèn)為其最佳檢測范圍是0～4 IU。對于HPA-3a和HPA-5b抗體，當(dāng)參比抗血清超過20 AU時，A450nm值達(dá)到較高水平（＞2.0），但仍然有升高的趨勢?？紤]到實際運用時，若待測樣品的測量值過高，會將其稀釋到一個合適的值，因此從節(jié)約成本的角度考慮，本研究并沒有去嘗試尋找其檢測范圍的上限值。從圖2可以看出，用本研究建立的MAIPA定量檢測方法檢測HPA-3a、HPA-5b抗體時，根據(jù)表2中的敏感性判斷，HPA-1a抗血清（03/152）檢測呈弱陽性，這可能是因為高濃度（10 IU）的HPA-1a抗體造成了非特異吸附。但在實際應(yīng)用中，如果未知樣本中有如此高濃度的HPA-1a抗體，則在HPA-1a抗體的MAIPA定量檢測方法中會顯示極強(qiáng)的陽性而被檢出；在采用MAIPA定量檢測方法檢測HPA-3a和HPA-5b抗體時，如僅顯示弱陽性，則可以認(rèn)為該樣本無HPA-3a、HPA-5b抗體，即使有少量該抗體，與高濃度的HPA-1a抗體相比其臨床意義也可基本忽略。因此該現(xiàn)象并不影響本研究建立的MAIPA定量檢測方法的臨床應(yīng)用。起初實驗時，HPA-3a和HPA-5b抗體檢測體系顯色普遍很低，為了提高敏感性，我們嘗試改變了多種條件。預(yù)實驗結(jié)果顯示，改變待測血清與PLT反應(yīng)的時間和溫度以及反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度對實驗結(jié)果的影響很小。改變反應(yīng)體系的pH值或加入少量聚乙二醇，可以微弱地增加反應(yīng)強(qiáng)度。而提高二抗?jié)舛?，尤其是HPA-3a和HPA-5b抗體檢測體系，可以大大增強(qiáng)反應(yīng)強(qiáng)度，提高敏感性。

本研究還得到了一些經(jīng)驗性的結(jié)論，如：提高PLT濃度對實驗的敏感性并無顯著的改善作用；酶免疫實驗中，封閉通常使用含一定濃度蛋白的試劑，而本研究中的封閉液是否含有蛋白成分卻對結(jié)果影響不大；HPA-1a抗原在PLT上數(shù)量較多，也較為穩(wěn)定，正常狀態(tài)下保存2周以上仍可以保持完整的抗原性，實驗效果依然較好，而HPA-3a和HPA-5b抗原表達(dá)量相對較低，所以反應(yīng)強(qiáng)度也相應(yīng)較弱，只能通過提高二抗?jié)舛鹊姆椒▉硖岣邫z測敏感性等。

本研究結(jié)果還顯示，影響MAIPA檢測結(jié)果的因素眾多，使用不同的單克隆抗體或不同保存方式的PLT等，得到的結(jié)果都不盡相同[17]。因此，雖然國內(nèi)早有利用MAIPA進(jìn)行臨床診斷的報道，但其僅用于定性分析，并沒有建立穩(wěn)定的檢測體系并得到定量的檢測結(jié)果[2-3]。本研究將MAIPIA方法中的各可控因素確定下來，獲得了準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均較好的MAIPA定量檢測方法，同時具有較高的敏感性和特異性，對于PLT輸注無效、新生兒同種免疫性PLT減少癥等疾病的診斷具有較高的應(yīng)用價值。

[1]秦平，侯明，孫建芝，等. 直接MAIPA對免疫性和非免疫性血小板減少性紫癜的鑒別診斷[J]. 中華血液學(xué)雜志，2005，26（3）：167-169.

[2]張穎琪，陳鈺，夏文權(quán)，等. 血小板抗體檢測方法的比較及其臨床應(yīng)用[J]. 上海醫(yī)學(xué)，1997，20（2）：95-97.

[3]胡翊群，BOEHLEN F，夏文權(quán)，等. 抗血小板抗原3a，5b（HPA-3a，5b）引起的新生兒同種免疫血小板減少癥[J]. 中華血液學(xué)雜志，1997，18（3）：40-41.

[4]DAVOREN A，CURTIS B R，ASTER R H，et al.Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1 162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia[J]. Transfusion，2004，44（8）： 1220-1225.

[5]KROLL H，YATES J，SANTOSO S. Immunization against a low-frequency human platelet alloantigen in fetal alloimmune thrombocytopenia is not a single event：characterization by the combined use of reference DNA and novel allele-specific cell lines expressing recombinant antigens[J]. Transfusion，2005，45（3）： 353-358.

[6]KIEFEL V，SANTOSO S，WEISHEIT M，et al.Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens（MAIPA）： a new tool for the identification of platelet-reactive antibodies[J].Blood，1987，70（6）： 1722-1726.

[7]KIEFEL V. The MAIPA assay and its applications in immunohaematology[J]. Transfus Med，1992，2（3）： 181-188.

[8]STOCKELBERG D，HOU M，JACOBSSON S，et al. Detection of platelet antibodies in chronic idiopathic throbocytopenic purpura（ITP）. A comparative study using flow cytometry，a whole platelet ELISA，and an antigen capture ELISA[J].Eur J Haematol，1996，56（1-2）： 72-77.

[9]BERTRAND G，JALLU V，GOUET M，et al.Quantification of human platelet antigen-1a antibodies with the monoclonal antibody immobilization of platelet antigens procedure[J]. Transfusion，2005，45（8）： 1319-1323.

[10]CAMPBELL K，RISHI K，HOWKINS G，et al. A modified rapid monoclonal antibodyspecific immobilization of platelet antigen assay for the detection of human platelet antigen（HPA）antibodies： a multicentre evaluation[J]. Vox Sang，2007，93（4）： 289-297.

[11]BRIGHTON T A，EVANS S，CASTALDI P A，et al. Prospective evaluation of the clinical usefulness of an antigen-specific assay（MAIPA） in idiopathic thrombocytopenic purpura and other immune thrombocytopenias[J]. Blood，1996，88（1）：194-201.

[12]BERTRAND G，MARTAGEIX C，JALLU V，et al. Predictive value of sequential maternal anti-HPA-1a antibody concentrations for the severity of fetal alloimmune thrombocytopenia[J]. J Thromb Haemost，2006，4（3）：628-637.

[13]KILLIE M K，HUSEBEKK A，KAPLAN C，et al.Maternal human platelet antigen-1a antibody level correlates with the platelet count in the newborns：a retrospective study[J]. Transfusion，2007，47（1）：55-58.

[14]SOCHER I，ZWINGEL C，SANTOSO S，et al. Heterogeneity of HPA-3 alloantibodies：consequences for the diagnosis of alloimmune thrombocytopenic syndromes[J]. Transfusion，2008，48（3）：463-472.

[15]DAVOREN A，SMITH G，LUCAS G，et al. Neonatal alloimmune thrombocytopenia due to HPA-3a antibodies： a case report[J].Immunohematology，2002，18（2）：33-36.

[16]BERTAND G，JALLU V，BERANGER T，et al.HPA-5 typing discrepancy reveals an Ile503Leu substitution in platelet GPIa（α2 integrin）[J]. Vox Sang，2013，105（1）：73-76.

[17]KILLIE M K，SALMA W，BERTELSEN E，et al.Quantitative MAIPA：comparison of different MAIPA protocols[J]. Transfus Apher Sci，2010，43（2）： 149-154.