耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的分子流行病學(xué)分析

史瑋煬， 劉 洋， 韓逸超， 鄭丹丹， 戴爾寬， 鄭 冰， 李 敏

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127）

肺炎克雷伯菌為臨床常見的革蘭陰性菌，是引起醫(yī)院感染的主要致病菌之一。目前臨床使用碳青霉烯類抗菌藥物治療肺炎克雷伯菌所致感染，但隨著此類藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對其耐藥性不斷增強(qiáng)。許多國家均已發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae， CRKP）菌株[1]，近年來我國肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性也呈逐年增強(qiáng)的趨勢，給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]。本研究對上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院分離的CRKP的耐藥性及同源性進(jìn)行分析，旨在為CRKP感染的臨床治療和醫(yī)院感染控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及鑒定

受試菌株為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科于2013年1月—2015年8月從臨床樣本中分離的CRKP（107株）。樣本來源為痰液、血液、引流液、中段尿、膽汁、咽拭和膿液樣本。

1.2 質(zhì)控菌株

藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922），聚合酶連反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌 （ATCC 700603），均購自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 試劑及儀器

血瓊脂平板購自美國BD公司。藥物敏感性紙片、水解酪蛋白胨平板購自英國Oxoid公司。PCR擴(kuò)增儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。SeaKem GOLD瓊脂糖粉購自美國Lonza公司，GelRed核酸染料購自美國Biotium公司，脈沖場電泳儀購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

1.4 細(xì)菌分離鑒定與體外藥物敏感性試驗(yàn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）的要求進(jìn)行。采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法測定受試菌株對亞胺培南、厄他培南、阿米卡星、青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、磷霉素、頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林和頭孢吡肟的敏感性。采用微量肉湯稀釋法測定美羅培南和替加環(huán)素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）并判定敏感性。紙片擴(kuò)散法及美羅培南的MIC測定結(jié)果參照CLSI 2015年標(biāo)準(zhǔn)判讀[3]。替加環(huán)素的MIC測定結(jié)果參照美國食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）判定折點(diǎn)[4]判讀。

1.5 碳青霉烯酶耐藥基因的擴(kuò)增

采用煮沸法提取107株菌株DNA，參照文獻(xiàn)[5-7]選取引物、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因（blaKPC-2、blaOXA-48、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-1、blaIMP-2、blaNDM-1）。檢出陽性基因的菌株取1株測序確認(rèn)，并將其作為陽性對照，將質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌 （ATCC 700603）作為陰性對照。引物序列見表1。

1.6 PFGE

從水解酪蛋白胨平板上挑取已培養(yǎng)過夜的純菌落，用1 mL細(xì)菌懸浮液混勻，吸取200 μL加入10 μL蛋白酶K。取0.1 g SeaKem GOLD瓊脂糖粉加入10 mL三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（methylaminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid，TE）緩沖液，54 ℃水浴30 min。將膠與菌懸液混合，加入模具中制備膠塊，使用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液消化4 h，棄去細(xì)胞裂解液，用預(yù)熱至55 ℃的超純水和TE緩沖液各洗3次，每次15 min。棄去液體，切下2 mm膠塊，加入含ApaI的酶切緩沖液100 μL，37 ℃酶切3 h。棄去酶切緩沖液，加入0.5×三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（methylaminomethane-boric acid-ethylenediaminetetraacetic acid，TBE）緩沖液200 μL。用0.5×TBE緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，把包埋有細(xì)菌的膠塊放入梳孔中。將膠塊至于電泳儀中進(jìn)行脈沖場電泳，電泳條件：相對分子質(zhì)量30 000～600 000，6 V/cm，脈沖時(shí)間5～20 s，14 ℃，電場角度120°，總時(shí)間為19 h。電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色膠塊。將膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，并轉(zhuǎn)換成圖像格式保存。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增的相應(yīng)引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用NTSYS（2.1）軟件中UPGMA算法進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖。將具有85%以上相同條帶（相關(guān)系數(shù)＞0.85）的菌株歸入同一型別[8]。

2 結(jié)果

2.1 樣本種類與病區(qū)分布

2013年1月—2015年8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院共分離1 821株肺炎克雷伯菌，其中CRKP 107株（5.9%）。樣本來源包括痰液（62.6%，67/107）、血液（11.2%，12/107）、引流液（11.2%，12/107）、中段尿（9.4%，10/107）、膽汁（2.8%，3/107）、咽拭（1.9%，2/107）和膿液（0.9%，1/107）。107株CRKP分離病區(qū)居前3位的分別為神經(jīng)外科（18.7%，20/107）、外科重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）（18.7%，20/107）和普外科（15.9%，17/107）。見表2。

表2 各病區(qū)CRKP分布及PFGE分型結(jié)果

2.2 耐藥性檢測

微量肉湯稀釋法測定MIC的結(jié)果顯示，在107株CRKP中對美羅培南耐藥的菌株占99.1%（106/107），中介的菌株占0.9%（1/107），敏感的菌株占0.0%（0/107），對替加環(huán)素耐藥的菌株占0.0%（0/107），中介的菌株占0.0%（0/107），敏感的菌株占100.0%（107/107）。紙片擴(kuò)散法結(jié)果顯示，受試菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑（29.0%）和磷霉素（74.7%）的耐藥率最低，對青霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南及厄他培南的耐藥率為100.0%，對阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、氨芐西林-舒巴坦、環(huán)丙沙星及哌拉西林的耐藥率均＞95.0%。見表3。

表3 107株CRKP對20種抗菌藥物的耐藥情況

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

在107株CRKP中檢出blaKPC-2基因陽性率為100.0%（107/107），blaIMP-1基因陽性率為0.9%（1/107），未檢測出blaOXA-48、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP-2和blaNDM-1基因。

2.4 PFGE結(jié)果

107株CRKP經(jīng)PFGE得到電泳圖譜，部分結(jié)果見圖1。經(jīng)NTSYS（2.1）軟件分析得出聚類圖（圖2）。將具有85%以上相同條帶（相關(guān)系數(shù)＞0.85）的菌株歸入同一帶型，107株CRKP被分為24個(gè)型別：A型[19.6%（21/107）]、B型[13.1%（14/107）]、C型[11.2%（12/107）]、D型[8.4%（9/107）]、E型[5.6%（6/107）]、F型[5.6%（6/107）]、G型[5.6%（6/107）]、H型[4.7%（5/107）]、I型[4.7%（5/107）]、J型[3.7%（4/107）]、K型[3.7%（3/107）]、L型[3.7%（3/107）]、M型[1.9%（2/107）]和N～X型各1株。A型、B型、C型為主要型別。A型21株菌株主要來自神經(jīng)外科（38.1%，8/21）。B型14株菌株主要來自神經(jīng)外科（28.6%，4/14）和急診內(nèi)科留觀室（28.6%，4/14）。C型12株菌株，分別分離自6個(gè)病區(qū)（表2）。在107株CRKP中，27株分離自無菌體液（包括血液12株、引流液12株和膽汁3株），含A型5株（18.5%）、C型4株（14.8%）、D型3株（11.1%）、F型3株（11.1%）、B型2株（7.4%）、E型2株（7.4%）、G型2株（7.4%），H型2株（7.4%）及I、M、O和U型各1株。

微量肉湯稀釋法，結(jié)果顯示替加環(huán)素耐藥CRKP共36株，包括A型7株，F(xiàn)型6株，C型4株，B型3株，D、E、H和M型各2株，G、I、J、O、P、Q和X型各1株。

21株A型CRKP中有15株（71.4%）分離于1個(gè)月內(nèi)（2015年5月29日—6月29日），其中神經(jīng)外科6株、門診3株、血液科2株、老年科2株、外科ICU 1株和泌尿外科1株。在6株F型CRKP中有4株分離于2周內(nèi)（2015年4月2—15日），普外科和老年科各2株。其余22型（B～E型，G～X型）共80株CRKP均散發(fā)于不同時(shí)期和不同病區(qū)，離散性較大。

圖1 部分CRKP的PFGE電泳圖

圖2 107株CRKP的PFGE聚類分析圖

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物可以有效治療肺炎克雷伯菌感染，但臨床不合理應(yīng)用抗菌藥物使耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌數(shù)量逐年增加。AGODI等[9]報(bào)道CRKP檢出率由2008年的0.0%增加至2013年的59.2%。CRKP的耐藥機(jī)制包括產(chǎn)抗菌藥物滅活酶、使抗菌藥物滲透障礙（生物被膜和外膜膜孔蛋白缺失）、基因變異導(dǎo)致藥物作用靶位改變、主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的亢進(jìn)作用等[10]。同時(shí)CRKP也可對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。

目前國內(nèi)外臨床治療CRKP選用的一線藥物包括碳青霉烯類、頭孢類（第3代、第4代）和喹諾酮類等抗菌藥物，二線藥物包括替加環(huán)素、多黏菌素類、磺胺類和氨基糖苷類等抗菌藥物[11]。國內(nèi)外對CRKP耐藥性的研究顯示，CRKP對復(fù)方磺胺甲噁唑、替加環(huán)素和阿米卡星的敏感性較高。張麗等[12]報(bào)道所檢CRKP敏感性最高的抗菌藥物為替加環(huán)素（83.3%）；UZ ZAMAN等[13]報(bào)道所檢CRKP敏感性最高的抗菌藥物為阿米卡星（8.7%）；BONURA等[14]報(bào)道對CRKP敏感性較高的抗菌藥物為多黏菌素（42.6%）、阿米卡星（40.4%）和慶大霉素（40.4%）。本研究受試CRKP對試驗(yàn)中應(yīng)用的碳青霉烯類、青霉素類、喹諾酮類和頭孢類抗菌藥物均不敏感，僅部分 CRKP對替加環(huán)素（100%）、磷霉素（24.0%）和阿米卡星（1.9%）具有敏感性。本研究受試CRKP對替加環(huán)素敏感率最高，與國內(nèi)外報(bào)道相一致。對阿米卡星敏感率較低，與國內(nèi)外研究報(bào)道存在一定差異，可能與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床藥物使用方法和習(xí)慣不同有關(guān)。值得注意的是，本研究有67.3%的受試CRKP對復(fù)方磺胺甲噁唑敏感，與目前國內(nèi)外研究相比敏感性較高，這對上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床治療有指導(dǎo)意義。因此，建議上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床治療CRKP感染患者首選替加環(huán)素或復(fù)方磺胺甲噁唑，同時(shí)應(yīng)注意減少治療時(shí)碳青霉烯類等各類抗菌藥物的濫用，防止CRKP耐藥形勢的進(jìn)一步惡化。

自1996年首次發(fā)現(xiàn)blaKPC酶以來，各國均有產(chǎn)blaKPC酶型CRKP流行的報(bào)道[15]，我國多地也報(bào)道了產(chǎn)blaKPC-2酶型CRKP的高檢出率，產(chǎn)blaKPC-2酶已成為我國肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因[16]。本研究分離的CRKP均檢出blaKPC-2基因，其余基因陽性率極低甚至無陽性，表明blaKPC-2酶是上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院CRKP感染患者對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)對CRKP的傳播與感染提高警惕，盡早采取措施檢測患者感染菌的耐藥情況，根據(jù)CRKP常見類型與特性選取合適的治療手段。

在多種肺炎克雷伯菌的流行病學(xué)分型方法中，PFGE是一種有效、應(yīng)用廣泛的技術(shù)，采用PFGE進(jìn)行分型可以研究菌株之間的遺傳差異，并為監(jiān)測傳染病的暴發(fā)流行、追蹤傳染源提供依據(jù)。

本研究采用PFGE將107株CRKP分為A型～X型，其中在A型21株CRKP中有15株（71.4%）分離于1個(gè)月內(nèi)（2015年5月29日—6月29日），在F型6株CRKP中有4株分離于2周內(nèi)（2015年4月2—15日）。醫(yī)院感染暴發(fā)定義為在醫(yī)療機(jī)構(gòu)或其科室的患者中，短時(shí)間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例[17]。因此根據(jù)本研究數(shù)據(jù)得出結(jié)論，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院于2015年5月29日—6月29日與2015年4月2—15日期間分別發(fā)生CRKP感染暴發(fā)，A型與F型菌株是導(dǎo)致上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院在這2個(gè)時(shí)期內(nèi)出現(xiàn)CRKP感染暴發(fā)的重要原因。其余22型菌株散發(fā)于不同時(shí)期和不同病區(qū)，判斷為散發(fā)菌株。

JIAO等[18]提出CRKP感染暴發(fā)與使用碳青霉烯類、糖肽類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、第3代頭孢菌素抗菌藥物，有氣管切開史和年齡增長等危險(xiǎn)因素有關(guān)。因此臨床應(yīng)格外重視抗菌藥物（尤其是碳青霉烯類、第3代頭孢菌素等抗菌藥物）的合理使用，重視接受侵襲性操作患者的感染防治，重視老年患者的有效護(hù)理與合理治療方案的制定。此外，神經(jīng)外科、外科ICU等高危病區(qū)患者自身情況較差，所患疾病較嚴(yán)重，多數(shù)患者有既往手術(shù)史，更易發(fā)生感染并遷延不愈，且長期使用各類抗菌藥物，易致病菌耐藥性增強(qiáng)，臨床應(yīng)加強(qiáng)對此類患者的護(hù)理，減少其與感染源接觸的機(jī)會(huì)，切斷感染途徑。

目前，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院2013年1月—2015年8月CRKP的傳播來源與傳播途徑尚未明確。有研究指出醫(yī)務(wù)人員雙手、醫(yī)療器械和環(huán)境表面可直接傳播耐藥菌株[19]，是病菌院內(nèi)傳播的主要原因。

肺炎克雷伯菌是一種重要的醫(yī)院感染致病菌，CRKP的出現(xiàn)增加了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床對肺炎克雷伯菌感染患者治療的難度，而院內(nèi)人員大量流動(dòng)以及科室間使用抗菌藥物習(xí)慣不同等多方面因素也將導(dǎo)致醫(yī)院CRKP型別的不斷演變，甚至出現(xiàn)新型別的流行傳播。因此，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)合理使用抗菌藥物，規(guī)范醫(yī)療操作步驟，控制肺炎克雷伯菌的耐藥狀態(tài)，同時(shí)注意病區(qū)內(nèi)與病區(qū)間預(yù)防措施的實(shí)施，避免此類病菌的院內(nèi)傳播和不斷演變。

[1]TSAKRIS A， KRISTO I， POULOU A， et al.First occurrence of KPC-2-possessing Klebsiella pneumoniae in a Greek hospital and recommendation for detection with boronic acid disc tests[J]. J Antimicrob Chemother， 2008， 62（6）： 1257-1260.

[2]胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2014年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志，2015，15（5）： 401-410.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. M100-S25， CLSI， 2015.

[4]王輝， 俞云松， 王明貴， 等. 替加環(huán)素體外藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程專家共識(shí)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013， 36（7）： 584-587.

[5]SHIBATA N， DOI Y， YAMANE K， et al. PCR typing of genetic determinants for metallo-betalactamases and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan， with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（12）：5407-5413.

[6]KRüTTGEN A， RAZAVI S， IM?HL M，et al.Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi metallo-β-lactamase-1（bla（NDM-1））[J]. Med Microbiol Immunol，2011， 200（2）： 137-141.

[7]SMITH MOLAND E， HANSON N D， HERRERA V L， et al. Plasmid-mediated， carbapenemhydrolysing beta-lactamase， KPC-2， in Klebsiella pneumoniae isolates[J]. J Antimicrob Chemother，2003， 51（3）： 711-714.

[8]TALON D， CAILLEAUX V， THOUVEREZ M，et al. Discriminatory power and usefulness of pulsedfield gel electrophoresis in epidemiological studies of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Hosp Infect， 1996，32（2）： 135-145.

[9]AGODI A， BARCHITTA M， QUATTROCCHI A， et al. Antibiotic trends of Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii resistance indicators in an intensive care unit of Southern Italy， 2008-2013[J].Antimicrob Resist Infect Control， 2015， 4： 43.

[10]SHAIKH S， FATIMA J， SHAKIL S， et al.Antibiotic resistance and extended spectrum betalactamases： types， epidemiology and treatment[J].Saudi J Biol Sci， 2015， 22（1）： 90-101.

[11]NEUNER E A， YEH J Y， HALL G S， et al.Treatment and outcomes in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections[J].Diagn Microbiol Infect Dis， 2011， 69（4）： 357-362.

[12]張麗， 朱元祺， 張小兵， 等. 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥基因檢測[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2014，24（23）： 5734-5736.

[13]UZ ZAMAN T， ALDREES M， AL JOHANI S M， et al. Multi-drug carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection carrying the OXA-48 gene and showing variations in outer membrane protein 36 causing an outbreak in a tertiary care hospital in Riyadh， Saudi Arabia[J]. Int J Infect Dis， 2014，28： 186-192.

[14]BONURA C， GIUFFRè M， ALEO A， et al. An update of the evolving epidemic of blaKPC carrying Klebsiella pneumoniae in Sicily， Italy， 2014：emergence of multiple non-ST258 clones[J]. PLoS One， 2015， 10（7）： e0132936.

[15]MUNOZ-PRICE L S， POIREL L， BONOMO R A， et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases[J]. Lancet Infect Dis， 2013， 13（9）： 785-796.

[16]CHENG L， CAO X L， ZHANG Z F， et al.Clonal dissemination of KPC-2 producing Klebsiella pneumoniae ST11 clone with high prevalence of oqxAB and rmtB in a tertiary hospital in China：results from a 3-year period[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob， 2016， 15： 1.

[17]中華人民共和國衛(wèi)生部. 醫(yī)院感染管理辦法[J]. 中國護(hù)理管理， 2006，6（7）： 5-7.

[18]JIAO Y， QIN Y， LIU J， et al. Risk factors for carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection/colonization and predictors of mortality： a retrospective study[J]. Pathog Glob Health， 2015，109（2）： 68-74.

[19]BEARMAN G M， ROSATO A， ELAM K，et al.A crossover trial of antimicrobial scrubs to reduce methicillin-resistant Staphylococcus aureus burden on healthcare worker apparel[J]. Infect Control Hosp Epidemiol， 2012， 33（3）： 268-275.