抗氨甲酰蛋白抗體與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性分析

陳燚瓊， 趙 迪， 任 方， 鄧曉剛， 徐 龍， 李 智

（同濟大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院檢驗科，上海 200090）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征是持續(xù)滑膜炎、全身性炎癥，血清中多可檢出自身抗體。RA的病因和發(fā)病機制目前仍知之甚少。及時診斷、及早治療對于RA的控制具有重要意義。迄今的研究已經(jīng)證實，對RA特異性最高的自身抗體是針對含瓜氨酸表位蛋白的自身抗體，這些抗體被稱為抗瓜氨酸蛋白抗體（anti-citrullinated protein antibody，ACPA）。ACPA陽性和ACPA陰性的RA患者在遺傳基因、環(huán)境危險因素、疾病的進展和緩解等方面都有所不同[1-2]。過去幾年的研究主要聚焦于ACPA陽性RA患者的病因?qū)W、病情進展和治療等方面，而對ACPA陰性的RA患者研究較少。近年有報道稱在RA患者體內(nèi)檢測出一種新的自身抗體系統(tǒng)——抗氨甲酰蛋白（carbamylated protein，Carp）抗體[3]。該抗體不僅能在ACPA陽性的RA患者血清中被檢測到，約有30%的ACPA陰性患者也能檢測到。本研究通過檢測RA患者血清中抗CarP抗體水平，初步探討抗CarP抗體在RA診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 RA組 選取2014年1月—2015年12月在同濟大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院風(fēng)濕科就診的門診及住院RA患者102例作為RA組，所有患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）制定的RA分類標準，其中男 34例、女68 例，年齡（61.2±12.2）歲。

1.1.2 非RA組 選取同期同濟大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院風(fēng)濕科除RA外的其他風(fēng)濕性疾病患者55例作為非RA組，其中男13例、女42例，年齡（53.2±13.1）歲，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE） 14例、原發(fā)性干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）15例、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）8例、骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）7例、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎2例、其他結(jié)締組織病9例。以上病例均符合相應(yīng)的專業(yè)診斷標準。

1.1.3 健康對照組 選取同期同濟大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院體檢健康者83名作為健康對照組，其中男32名、女51名，年齡（58.7±11.8）歲。

1.2 試劑與檢測方法

1.2.1 試劑 牛血清白蛋白V、氰酸鉀和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗人IgG、IgA均購自美國Sigma公司。

1.2.2 檢測方法 采集患者及健康對照組人群空腹靜脈血5 mL，離心后分裝血清，置于-80 ℃低溫冰箱中保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）檢測抗Carp抗體，參照文獻[3]進行操作，用生理鹽水溶解牛血清白蛋白V，使其終濃度為4 mg/mL，加入1 mol/L氰酸鉀，37 ℃孵育12 h，用去離子水透析除鹽，以1 500×g離心15 min去除沉淀物，上清即為含高瓜氨酸殘基的牛血清白蛋白。用pH值9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋蛋白濃度至10 μg/mL，包被96孔微孔板，50 μL/孔，4 ℃放置過夜，用含0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌3次，用含1%牛血清白蛋白的PBS封閉微孔，100 μL/孔，充分洗滌后，拍干備用。待測血清標本用含0.05%Tween20和1%牛血清白蛋白的PBS作50倍稀釋，以50 μL/孔劑量加入已包被好的微孔板中，室溫孵育2 h，用上述洗滌緩沖液洗滌后，加入稀釋好的HRP標記的兔抗人IgG （50 μL/孔），室溫孵育2 h。充分洗滌并常規(guī)顯色，讀取各孔吸光度（A）值。每份標本均設(shè)復(fù)孔。將復(fù)孔A均值轉(zhuǎn)換為任意單位aU/mL，臨界值為健康對照的x ±2s。抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體采用Cobas e601電化學(xué)發(fā)光分析儀（德國羅氏診斷有限公司）及配套試劑檢測，類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）、補體（complement，C）3、C4、IgG、IgA、IgM采用BNⅡ特定蛋白分析儀（德國西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司）及配套試劑檢測。

1.2.3 抗Carp抗體檢測方法的性能 抗Carp IgG抗體批內(nèi)精密度低值為8.06%，高值為5.92%；批間精密度低值為7.52%，高值為5.34%；檢測范圍為1.27～15.08 U/L?？笴arp IgA抗體批內(nèi)精密度低值為7.62%，高值為6.18%；批間精密度低值為7.02%，高值為5.91%；檢測范圍為1.00～13.32 U/L。抗Carp抗體的檢測結(jié)果不受黃疸（膽紅素＜302 μmol/L）、溶血（血紅蛋白＜4.76 g/L）和脂血（甘油三酯＜5.14 mmol/L）的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析和兩兩比較的q檢驗，2個組比較采用t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（率或構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗，變量之間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp抗體水平及陽性率的比較

RA組血清抗Carp IgG抗體水平為（8.60±2.64） U/L，陽性率為42.16%，抗Carp IgA抗體水平為（6.65±3.09） U/L，陽性率為46.08%，均高于非RA組和健康對照組（P＜0.05）；非RA組抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體水平和陽性率亦高于健康對照組（P＜0.05），見表1、表2。將健康對照組抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體水平的x ±2s視為陽性閾值，計算出抗Carp IgG抗體對RA的診斷敏感性為42.16%，特異性為89.13%；抗Carp IgA抗體對RA的診斷敏感性為46.08%，特異性為86.96%。并根據(jù)此標準將RA組分為抗Carp抗體陽性組和抗Carp抗體陰性組。

2.2 抗CCP抗體陰性RA患者中血清抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體的陽性率

在RA患者中，抗CCP抗體和抗Carp IgG抗體均陰性者占7.84%，抗CCP抗體和抗Carp IgA抗體均陰性者占9.80%。在抗CCP抗體陰性的RA患者中抗Carp IgG抗體的陽性率為46.67%，抗Carp IgA抗體的陽性率為33.33%。

表1 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp IgG抗體水平和陽性率比較

表2 RA組、非RA組、健康對照組血清抗Carp IgA抗體水平和陽性率比較

2.3 RA患者抗Carp抗體與相關(guān)實驗室指標的關(guān)系

2.3.1 抗Carp抗體水平與RA相關(guān)實驗室指標的關(guān)系 抗Carp IgG抗體陽性和陰性RA患者性別、年齡、C3、C4、RF和抗CCP抗體差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而IgG、IgA和IgM差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3?？笴arp IgA抗體陽性和陰性RA患者性別、年齡、C3、RF和抗CCP抗體差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而IgG、IgA、IgM和C4差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

2.3.2 抗Carp抗體與RA相關(guān)實驗室指標的相關(guān)性分析 RA患者抗Carp IgG抗體與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、C3和C4無明顯相關(guān)性（P＞0.05），但與IgG、IgA和IgM呈正相關(guān)（r值分別為0.077、0.162和0.133，P＜0.05）；抗Carp IgA抗體與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、IgM和C4無明顯相關(guān)性（P＞0.05），但與IgG和IgA呈正相關(guān)（r值分別為0.045、0.333，P＜0.05），與C3呈負相關(guān)（r=-0.049，P＜0.05）。

表3 血清抗Carp IgG抗體陽性組與陰性組RA患者實驗室指標的比較

表4 血清抗Carp IgA抗體陽性組與陰性組RA患者實驗室指標比較

3 討論

氨基甲?；且粋€非酶促的化學(xué)反應(yīng)過程，在這個反應(yīng)中，氰酸鹽介導(dǎo)賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖习彼帷Ｇ杷猁}是氨基甲?；匦璧奈镔|(zhì)，其在人體內(nèi)天然存在且與尿素保持平衡[4]。在生理狀態(tài)下尿素的水平相當?shù)?，蛋白的氨基甲?；蔡幱诘退?。但特殊情況下，尤其是長半衰期的蛋白如基質(zhì)分子易發(fā)生氨基甲?；?。腎功能衰竭時，由于尿素水平升高，蛋白的氨基甲?；餐皆黾覽5]；吸煙作為RA最主要的環(huán)境危險因子，可能通過增加氰酸鹽的水平來提高氨基甲酰化水平[6]；慢性炎癥會發(fā)生廣泛的氨基甲?；?，因為中性粒細胞釋放過氧化物酶，該酶能將硫氰酸鹽轉(zhuǎn)化為氰酸鹽[6]。吸煙和慢性炎癥是RA重要的致病因素，由此提示蛋白的氨基甲?；赡軈⑴c了RA的發(fā)病機制。

SHI等[3]發(fā)現(xiàn)有45%的RA患者抗Carp IgG抗體陽性，有43%的RA患者抗Carp IgA抗體陽性，而且重要的是約有16%的ACPA陰性RA患者可檢測到抗Carp IgG抗體，30%的ACPA陰性患者可檢測到抗Carp IgA抗體，抗Carp抗體與疾病的嚴重程度，主要是更高的關(guān)節(jié)損傷率有關(guān)。但有關(guān)抗Carp抗體與RA相關(guān)實驗室指標之間的關(guān)系尚未見報道，關(guān)于抗Carp抗體對RA診斷的特異性國外報道也很少，國內(nèi)未見報道，而且國外研究對象主要為高加索人種。為此，本研究探討了抗Carp抗體在我國RA患者中的表達情況。

本研究結(jié)果顯示RA組血清抗Carp IgG抗體、抗Carp IgA抗體的水平和陽性率均高于非RA組和健康對照組（P＜0.05）?？笴arp IgG抗體對RA的診斷敏感性為42.16%，特異性為89.13%；抗Carp IgA抗體對RA的診斷敏感性為46.08%，特異性為86.96%。其診斷敏感性與SHI等[3]、SCINOCCA等[7]的研究結(jié)果基本一致，診斷特異性稍低于SCINOCCA等[7]的報道，可能與RA對照組中納入的病種和病例數(shù)不同有關(guān)，也可能與地域及研究對象的遺傳背景不同有關(guān)。本研究結(jié)果還表明抗CCP抗體陰性的RA患者抗Carp IgA抗體的陽性率為33.33%，與文獻報道[3-8]一致；抗Carp IgG抗體的陽性率為46.67%，高于SHI等[3]的報道。結(jié)果不一致的原因可能與RA組納入的病例病程不同有關(guān)。SHI等[3]的研究對象為病程＜2年的RA患者，隨訪1年，本研究對RA患者的病程未作嚴格的限制，有的病程長達30年。

本研究對抗Carp抗體與其他實驗室指標進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗Carp IgG抗體陽性組IgG、IgA、IgM水平均明顯高于抗Carp IgG抗體陰性組，抗Carp IgA抗體陽性組IgG、IgA、IgM水平均明顯高于抗Carp IgA抗體陰性組，C4水平均明顯低于抗Carp IgA抗體陰性組；并且相關(guān)性分析也表明，抗Carp IgG抗體與IgG、IgA和IgM呈正相關(guān)，抗Carp IgA抗體與IgG和IgA呈正相關(guān)。這些結(jié)果提示抗Carp抗體可能與疾病的進展有關(guān)，其作為RA診斷和鑒別診斷及預(yù)后評估的血清學(xué)標志物的臨床意義值得進一步研究。同時抗Carp抗體是否與疾病的嚴重程度，即與患者的臨床指標如影像學(xué)表現(xiàn)、病情活動指數(shù)——RA疾病活動性評分系統(tǒng)等相關(guān)也值得關(guān)注。

綜上所述，RA患者血清中可以檢測到抗Carp抗體，對診斷RA有一定的敏感性和較高的特異性，尤其是在抗CCP抗體陰性的RA患者中也有一定的檢出率，這有助于抗CCP抗體陰性RA的診斷，提示其與抗CCP抗體、RF聯(lián)合檢測有助于提高RA的診斷率，且抗Carp抗體與疾病嚴重程度有一定的相關(guān)性，可作為臨床上診療RA的一個新的血清學(xué)指標。進一步研究抗Carp抗體的應(yīng)用價值對于研究RA的發(fā)病機制及診療方法具有重要的意義。

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