廣州地區(qū)不同檢測系統(tǒng)精子濃度和精子活動力參考區(qū)間的建立及驗證

石漢振， 陳 西， 曾冬玉

（1.廣東省中醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510120；2.中山大學北校區(qū)醫(yī)學檢驗系，廣東 廣州 510120；3.越秀區(qū)登峰社區(qū)衛(wèi)生服務中心，廣東 廣州 510120）

男性精液質(zhì)量是男性生育能力評價、優(yōu)生優(yōu)育的重要指標。目前，我國男性精液質(zhì)量水平尚缺乏客觀的、大范圍的調(diào)查。國內(nèi)外關(guān)于使用不同檢測系統(tǒng)或不同檢測方法進行精液參考區(qū)間調(diào)查的相關(guān)研究亦較少。黃春妍等[1]的研究結(jié)果顯示，1985—1995年間國內(nèi)男性精液質(zhì)量未見明顯變化，而1995—2008年14年間精子密度和精子總數(shù)明顯降低，可能與我國進入重化工時代引起環(huán)境污染有關(guān)。近30年來，多數(shù)研究認為生育期男性精液質(zhì)量逐漸下降，但由于多數(shù)文獻不是大樣本隨機對照分析，因此該定論尚缺乏說服力[2]，也有少數(shù)研究認為精液質(zhì)量下降證據(jù)尚不充分[3]。精液質(zhì)量研究數(shù)據(jù)最早可追溯到1970年，已發(fā)表的大部分研究是回顧性的，對混雜因素和偏移難以控制，這可能是結(jié)果不一致的原因[4]。

2010年出版的《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）[5]［以下簡稱世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）手冊］中修訂的精子活力分級標準、精子形態(tài)學的嚴格標準和較低的正常參考值（4%）逐漸被國內(nèi)多數(shù)男科實驗室采用[6]。但WHO手冊對精液常規(guī)參考區(qū)間的設定中并沒有涉及來自占世界人口1/5的中國人群的任何臨床數(shù)據(jù)和資料[7]。因此，盡管WHO手冊非常重要，但能否適用于中國人群仍需評估[8]。為此，本研究按不同地域人群及檢測系統(tǒng)建立精液常規(guī)分析主要指標（精子濃度、精子活動力）的參考區(qū)間，并驗證其是否適用于廣州地區(qū)的人群，以期為輔助生殖技術(shù)實施提供更準確、可靠的精液質(zhì)量數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2015年10月—2016年2月廣東省中醫(yī)院145名體檢健康男性的精液標本。

1.2 入選及排除標準

145份標本均來自2年內(nèi)已生育過健康孩子的男性，排除生殖道或泌尿道慢性炎癥、遺傳性疾病、生殖道器質(zhì)性疾病和有嚴重生活不良習慣者。由于精子質(zhì)量存在地域性和種族間差異，環(huán)境因素如有毒物質(zhì)、殺蟲劑、油漆等化學物質(zhì)暴露可影響精液質(zhì)量，體質(zhì)指數(shù)和營養(yǎng)狀況對精液質(zhì)量的影響也是不可忽視的，另外吸煙、飲酒、久坐工作等生活方式也可對男性生殖健康造成損害。因此，在選取參考個體時要考慮排除以上的影響因素。

1.3 儀器與試劑

SCA精子質(zhì)量分析儀（西班牙Microptic公司）、Marker計數(shù)板、改良牛鮑計數(shù)板、恒溫水浴箱、光學顯微鏡、精子固定液、玻璃染缸、玻片、蓋玻片和10 mL塑料試管。

1.4 方法

1.4.1 收集標本 要求受試者禁欲2～7 d，取精室手淫取精，收集1次射精的全部精液于清潔、無毒密閉容器內(nèi)，置37 ℃水浴箱中，待液化后進行精液分析。

1.4.2 計算機輔助精液分析系統(tǒng)（computer assisted sperm analysis，CASA）操作步驟 將1滴已液化的精液均勻涂抹在潔凈玻片上，在顯微鏡低倍鏡下作初步鏡檢。根據(jù)精子濃度估算稀釋倍數(shù)，用生理鹽水將精子濃度調(diào)整到（20～50）×106/mL，用加樣槍吸取10 μL精液加樣到專用計數(shù)板上；使用SCA精子質(zhì)量分析儀檢測精子濃度、前向精子總數(shù)、總活動率、前向活動率。

1.4.3 Marker計數(shù)板操作步驟 將按適當比例稀釋后的精液吸取10 μL滴于Marker平盤中心區(qū)域，將蓋子蓋上，于20倍物鏡顯微鏡下找到視野后計數(shù)10個方格，計算精子濃度，并使用計數(shù)器分類計算精子活動力。

1.4.4 改良牛鮑計數(shù)板操作步驟 將計數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央計數(shù)室上加蓋專用厚玻片。將稀釋后的精液用吸管吸取1滴置于蓋玻片邊緣，使精液緩緩滲入，室溫放置3 min，待精子全部沉降到計數(shù)室內(nèi)后計數(shù)16個小方格內(nèi)的精子數(shù)量。每份標本均計數(shù)3次，取平均值，按公式計算精子濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法

1.5.1 建立參考區(qū)間 去除離群值采用Dixon 所提出的1/3規(guī)則。D值指一個極端觀測值（大的或小的值）和另一個極端觀測值（第二大或第二小的值）之間的絕對差值，而R值指所有觀測值全距，即最大極值和最小極值差值。如某個觀測值D值≥1/3 R值，就應剔除該極值。去除離群值后，隨機抽取不少于120例進行分析。采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，單側(cè)參考區(qū)間取95%可信區(qū)間[10]。

1.5.2 驗證參考區(qū)間 從健康體檢人群中另抽取20名健康個體（2年內(nèi)已生育的男性）進行精液常規(guī)分析。如20名健康個體中只有不超過2名個體的檢測值超出原始參考區(qū)間（取95%可信區(qū)間），即通過驗證［11］。

1.6 質(zhì)量控制

精液檢驗質(zhì)量控制環(huán)節(jié)應規(guī)范受試者采樣前準備（包括禁欲時間）和精液采集方法、及時送檢、37 ℃溫浴避免精子自身破壞溶解、標本收集后及時處理[12]。分析過程中應注意加樣、稀釋的規(guī)范操作，盡量由同一實驗人員進行操作，以減少人為誤差，同一標本可做2次或多次平行試驗，以縮小隨機誤差。對使用的設備、儀器、試劑、加樣槍校準、質(zhì)控應有標準操作規(guī)程。同一標本應選取不同視野重復計數(shù)，嚴格遵循WHO手冊上“對一定總數(shù)2個重復計數(shù)可接收差異”的要求，控制主觀因素引起的誤差[9]。此外，為保證避免儀器本身帶來的誤差，需依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件對3種儀器進行正確度評價。收集5份標本（結(jié)果盡量分散于檢測范圍高、中、低點）分別用3種儀器進行精子濃度與活動力檢測。以牛鮑計數(shù)板為參考系統(tǒng)，比較Marker計數(shù)板和CASA的相對偏移，如果相對偏移＞15%，需查找原因，對Marker計數(shù)板和CASA進行校準。

2 結(jié)果

145名受試者檢測結(jié)果均呈正態(tài)分布，其中有8個離群值，按照要求予以剔除，剩余137個結(jié)果用于統(tǒng)計。

CASA、Marker計數(shù)板、改良牛鮑計數(shù)板檢測精子濃度的參考區(qū)間分別為≥27.60×106/mL、≥35.40×106/mL、≥31.00×106/mL。CASA、Marker計數(shù)板檢測精子總活動力的參考區(qū)間分別為≥40.90%、≥49.40%，前向活動力的參考區(qū)間分別為≥32.20%、≥35.00%。用于驗證的20名健康個體的精液常規(guī)檢測結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。本研究建立的參考區(qū)間見表1。不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析單側(cè)生物參考區(qū)間低值及95%可信區(qū)間見表2。

表1 不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析結(jié)果

表2 不同檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析參考區(qū)間低值及95%可信區(qū)間

3 討論

參考區(qū)間是目前臨床實驗室最常用的解釋檢驗報告的一個“決策支持工具”[13]。臨床實驗室的檢測結(jié)果常與參考區(qū)間作比較，以判斷其有無臨床意義。不同地區(qū)健康人群的實驗室檢驗結(jié)果有顯著差異[14]。ICHIHARA等[15]進行的一項隨訪研究不僅證實了文獻[14]的研究結(jié)果，還指出了差異的生物學基礎。參考區(qū)間建立要注意以下問題：（1）生物屬性帶來參考區(qū)間的差異（主要是年齡、性別、民族、居住地域及妊娠等原因引起的差異）[16]；（2）對于同一項目的檢測方法可能有多種等[17]。因此，各實驗室有必要建立自己的參考區(qū)間。簡單地引用文獻或直接采用廠商給定的參考區(qū)間是不可取的。目前，建立適合我國人群檢驗項目的參考區(qū)間具有重要的臨床意義和社會價值。通過轉(zhuǎn)移驗證已建立的參考區(qū)間來確定自己實驗室的參考區(qū)間，可以避免不必要的重復檢測或臨床干預，有效提高臨床醫(yī)生評價患者精液質(zhì)量及生育能力的診斷準確性，且同時為輔助生殖技術(shù)提供更準確的實驗室診斷。

精子濃度及活動力檢測有多種方法，但WHO手冊中只有手工方法（改良牛鮑計數(shù)板）的參考區(qū)間。隨著CASA在我國男科實驗室中的廣泛應用，使用計數(shù)池計數(shù)精子的男科實驗室越來越少。此外，Marker計數(shù)板也是常規(guī)用于精子濃度計數(shù)的工具之一[18-19]。因此，迫切需要建立這2種方法的參考區(qū)間。為此，結(jié)合地區(qū)人群差異，本研究建立了廣州地區(qū)3種檢測系統(tǒng)精液常規(guī)分析主要指標的參考區(qū)間。

將本研究建立的精液質(zhì)量參考區(qū)間與WHO手冊比較，其中精子濃度及精子總數(shù)二者差異較大，主要是由本研究納入病例數(shù)不多、方法學差異、檢測技術(shù)誤差等原因引起。精子活動力差異較小，差異可能是由檢測技術(shù)誤差以及CASA將精液中其他雜質(zhì)錯誤分類等原因引起。因此，在以后的研究中將通過增大納入病例數(shù)、減少檢測技術(shù)誤差等手段對精液質(zhì)量參考區(qū)間進行修正。按WHO手冊要求，精液參考區(qū)間納入試驗者要求是其配偶在停止使用避孕措施后12個月內(nèi)懷孕，但招募這類課題參與者困難很大，因此本研究將妊娠期限定為24個月內(nèi)。此外，由于目前精液檢查儀器或方法缺乏權(quán)威性室間質(zhì)評結(jié)果及性能評價方法，因此均可能造成實驗結(jié)果發(fā)生偏差。

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