抗雙鏈DNA抗體水平和抗體親和力與SLE患者疾病狀態(tài)的關(guān)系以及對兩種方法檢測能力的影響*

田 野，張云聰，馮珍如，閆惠平，張 巖，張海萍，李 佩，鄭芳芳，聶秋燕，劉 晴，王曉寧，張國軍,譚延國△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院檢驗科 100038；2.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院臨床檢驗中心 100069；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗診斷中心 100050)

抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的特征性血清標(biāo)志物，該抗體陽性是SLE的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，并用于SLE患者病情活動程度、腎臟受累和治療監(jiān)測的指標(biāo)?？贵w陽性的健康個體將來發(fā)生SLE的風(fēng)險也較高。筆者先前的研究發(fā)現(xiàn)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫熒光法(IIF)檢測抗dsDNA抗體，具有較好的互補(bǔ)性，聯(lián)合兩種方法可以較大程度地提升其在SLE患者中的檢出率；在非SLE自身免疫性疾病抗dsDNA抗體陽性的個體中，ELISA單獨(dú)陽性的比例為66.7%，而SLE患者中這一比例為30.5%[1]。基于上述發(fā)現(xiàn)，有必要進(jìn)一步探討ELISA和IIF對抗dsDNA抗體檢出能力具有較明顯差異的深層次原因，以及SLE與非SLE自身免疫性疾病患者血清中抗dsDNA抗體性質(zhì)的異同?？筪sDNA抗體親和力與SLE病情關(guān)系的相關(guān)研究提示造成上述現(xiàn)象深層次原因可能與抗dsDNA抗體的親和力有關(guān)[2-4]。為此，本研究使用ELISA和IIF同時檢測SLE和非SLE自身免疫性疾病患者血清抗dsDNA抗體，對ELISA檢測為陽性的標(biāo)本進(jìn)一步測定其抗體親和力指數(shù)，并評估抗dsDNA抗體水平和抗體親和力指數(shù)與SLE疾病狀態(tài)以及檢測方法間的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 留取2014年5月至2015年6月于北京大學(xué)第一醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院和北京佑安醫(yī)院就診患者血清標(biāo)本共計1 095例。其中SLE患者300例(SLE組),男47例、女253例，平均年齡(37±11)歲；非SLE自身免疫性疾病患者共495例(非SLE疾病組)，包括干燥綜合征(SS)100例[男12例、女88例，平均年齡(54±16)歲]，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)98例[男22例、女76例，平均年齡(55±14)歲]，原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)100例[男9例、女91例，平均年齡(54±12)歲]，小血管炎(SV)100例[男43例、女57例，平均年齡(58±14)歲]，以及包括結(jié)締組織病、克羅恩病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等在內(nèi)的97例患者[男39例、女58例，平均年齡(43±12)歲]；300例健康人作為健康對照組，男150例、女150例，平均年齡(34±10)歲。SLE的診斷依據(jù)參照1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。其他自身免疫性疾病的診斷分別按相關(guān)指南進(jìn)行。并對120例SLE患者的疾病活動度進(jìn)行評分(SLEDAI2000評分標(biāo)準(zhǔn))。SLEDAI評分≤4分患者被認(rèn)為處于疾病穩(wěn)定期，SLEDAI評分>4分則處于疾病活動期。

1.2試劑與儀器 ELISA試劑使用德國歐蒙公司的抗dsDNA-NcX抗體檢測試劑盒，IIF試劑選用歐蒙公司的間接免疫熒光檢測抗dsDNA抗體試劑盒。全自動酶標(biāo)儀為愛得康公司ADDCARE500，熒光顯微鏡為奧林巴斯CX40。

1.3方法 采用未加抗凝劑的普通采血管采集所有研究對象的靜脈全血，分離血清后，置于-80 ℃冰箱保存待用。所有標(biāo)本用ELISA和IIF同時檢測抗dsDNA抗體，然后進(jìn)一步測定ELISA檢測為陽性標(biāo)本的抗體親和力指數(shù)。在保證實(shí)驗環(huán)境和儀器處于最佳狀態(tài)下，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗操作?？筪sDNA抗體親和力指數(shù)檢測方法(尿素變性法)：對ELISA檢測抗dsDNA抗體為陽性的標(biāo)本重新用ELISA進(jìn)行測定，每個標(biāo)本設(shè)立實(shí)驗孔和對照孔。加入稀釋的血清標(biāo)本溫育后洗板1次，實(shí)驗孔加入200 μL尿素溶液，對照孔加入200 μL洗液，作用10 min后洗板，以洗脫掉實(shí)驗孔中的低親和力抗體。其余檢測步驟同抗dsDNA抗體。抗體親和力指數(shù)=A實(shí)驗孔/A對照孔×100 (A為吸光度)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M(P25～P75)描述，使用Spearman相關(guān)性分析、直線回歸分析。兩標(biāo)本間抗dsDNA抗體水平及抗體親和力的比較采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(Mann-WhitneyU檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1抗dsDNA抗體水平及其親和力指數(shù)在不同人群中的分布 健康對照組中未檢出抗dsDNA抗體陽性個體。抗dsDNA抗體陽性個體中，SLE組有127例，非SLE疾病組有6例。SLE組抗dsDNA抗體水平明顯高于非SLE疾病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； SLE組抗dsDNA抗體親和力指數(shù)與非SLE疾病組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。300例SLE患者中，有120例進(jìn)行了SLEDAI評分，明確為活動期的標(biāo)本96例(其中47例抗dsDNA抗體陽性)，穩(wěn)定期為24例(其中3例抗dsDNA抗體陽性)?；顒悠诘腟LE患者抗dsDNA抗體水平[96.7(12.1～383.9)IU/mL]明顯高于穩(wěn)定期SLE患者的抗dsDNA抗體水平[20.9(0.001～52.6)IU/mL],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2抗dsDNA抗體水平及抗體親和力指數(shù)與SLE疾病活動度的關(guān)系 120例SLE患者(其中50例抗dsDNA抗體陽性)抗dsDNA抗體水平與SLEDAI評分相關(guān)系數(shù)(r)=0.435，P=0.000，回歸方程為Y=10.25+0.012X；對于50例抗dsDNA抗體陽性患者，抗dsDNA抗體親和力指數(shù)與SLEDAI評分呈顯著正相關(guān)(r=0.326，P=0.02)，回歸方程為Y=13.48+0.081X。

表1 兩組ELISA檢測陽性患者抗dsDNA抗體水平和抗體親和力指數(shù)比較[M(P25～P75)]

注：與非SLE疾病組比較，*P<0.05

2.3ELISA和IIF對不同親和力抗dsDNA抗體的檢測能力 133例ELISA檢測抗dsDNA抗體為陽性的標(biāo)本中，IIF也呈陽性的為77例(ELISA和IIF均陽性組)，其抗體親和力指數(shù)為33.1(23.5～52.7)；IIF陰性為56例(ELISA單陽性組)，其抗體親和力指數(shù)為22.1(13.6～48.1)。ELISA和IIF均呈陽性組抗dsDNA抗體親和力指數(shù)明顯高于ELISA單陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024)。就抗dsDNA抗體水平而言，ELISA和IIF均陽性組為355.6(236.1～547.1)IU/mL,明顯高于ELISA單陽性組的196.2(148.9～300.6)IU/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

3 討 論

在SLE患者體內(nèi)，作為抗原物質(zhì)的抗dsDNA誘導(dǎo)并活化B淋巴細(xì)胞，進(jìn)而合成致病性抗dsDNA抗體。該抗體與疾病的關(guān)系已被廣泛研究[3-5]。檢測抗dsDNA抗體最常用的方法是ELISA和IIF，由于ELISA可以定量檢測抗dsDNA抗體水平，便于觀察治療效果，故而被廣泛使用。測定抗dsDNA抗體親和力的方法有放射免疫方法、色譜技術(shù)及ELISA等，但以ELISA最常用。本研究在ELISA的基礎(chǔ)上，采用尿素變性技術(shù)構(gòu)建而成[6]。筆者先前的研究顯示，抗dsDNA抗體在SLE人群中的檢出率(ELISA：42.3%，IIF：38%)明顯高于非SLE疾病組(ELISA：1.2%，IFF：0.8%)和健康對照組(ELISA：0.0%，IIF：0.0%)[1]。本研究進(jìn)一步分析了抗dsDNA抗體陽性的標(biāo)本，其抗體水平和親和力指數(shù)在不同人群中的分布狀況。

本研究在抗dsDNA抗體陽性的患者中，SLE組抗dsDNA抗體水平明顯高于非SLE疾病組，同時SLE疾病活動期抗dsDNA抗體水平也明顯高于穩(wěn)定期患者?？筪sDNA抗體水平增高則疾病活動程度(SLEDAI評分)有增加趨勢，這點(diǎn)與先前的研究結(jié)果相符[7]。以上結(jié)果進(jìn)一步驗證了抗dsDNA抗體參與了SLE的病理生理過程，以及與SLE患者疾病活動性的緊密關(guān)系。

本研究抗dsDNA抗體親和力指數(shù)SLE組為32.3(19.2～50.7)，與非SLE疾病組的15.5(9.5～49.8)相比，雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，還是可以明顯看出前者高于后者的趨勢。之所以差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是非SLE疾病組抗dsDNA陽性例數(shù)過少所致(6例)。另外，由于處于穩(wěn)定期的24例SLE患者中，只有3例抗dsDNA抗體陽性，故未就活動期以及穩(wěn)定期SLE患者抗dsDNA抗體的親和力進(jìn)行進(jìn)一步比較。上述兩部分內(nèi)容需要增加樣本量后進(jìn)一步研究。

本研究顯示，抗dsDNA抗體親和力指數(shù)越高， SLE患者疾病越活躍；而且隨著抗體水平的增高，抗dsDNA抗體親和力也逐漸趨于成熟，這也驗證了SUH-LAILAM等[4]的結(jié)果。故臨床工作中，在對抗dsDNA抗體進(jìn)行定性和定量檢測的同時，測定抗dsDNA抗體的親和力指數(shù)也能從另一個側(cè)面反映疾病的嚴(yán)重程度。

ELISA與IIF兩種方法檢測抗dsDNA抗體結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能是因為包被抗原的種類、來源及流程存在差別所致，導(dǎo)致對不同親和力的抗dsDNA抗體的檢出能力不同[8-9]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，ELISA和IIF均陽性的標(biāo)本，其抗dsDNA抗體親和力指數(shù)明顯高于單獨(dú)ELISA陽性標(biāo)本。這與之前缺乏證據(jù)支持的IIF檢測抗dsDNA抗體所針對的親和力譜位于中、高親和力的觀點(diǎn)相符。也就是說，某些ELISA檢測抗dsDNA抗體單獨(dú)陽性的SLE及非SLE自身免疫性疾病患者是因為體內(nèi)抗體水平較低且為低親和力抗體所致。但對于非SLE個體，隨著抗體水平的增加和抗體親和力成熟，其致病性逐漸增強(qiáng)，有機(jī)會發(fā)展為SLE，這可能是抗dsDNA抗體陽性的個體將來發(fā)展為SLE的根源所在。

總之，尿素變性法檢測抗dsDNA抗體親和力指數(shù)切實(shí)可行。隨著抗dsDNA抗體水平和抗體親和力指數(shù)的增加，SLE患者疾病有變得活躍和趨于惡化的傾向。IIF和ELISA對抗dsDNA抗體親和力譜具有不同的識別能力。

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