HPV E6/E7mRNA在宮頸癌中的應(yīng)用進(jìn)展

蘇瑛 謝婷婷 于月成

宮頸癌是最常見的危害女性健康的婦科惡性腫瘤之一，WHO發(fā)布的全球癌癥報(bào)告顯示，2012年世界宮頸癌新發(fā)病例約52.7萬例，死亡病例約26.5萬例，約85%的病例集中在發(fā)展中國(guó)家[1]。大量病因?qū)W及流行病學(xué)研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要病因，約99.7%的宮頸癌組織中可以檢測(cè)到HR-HPV的存在[2]，但是HPV確切的致病機(jī)制尚未完全闡明。隨著分子診斷在腫瘤早期篩查及個(gè)性化診斷等領(lǐng)域的快速發(fā)展，Nakagawa發(fā)現(xiàn)的HPV E6/E7mRNA分子備受關(guān)注。研究表明HPV mRNA在病毒與宿主基因持續(xù)整合時(shí)表達(dá)上調(diào)，并與宮頸病變和癌變關(guān)系密切，在宮頸癌篩查和分流中已顯現(xiàn)出重要作用。理論上該分子也有可能用于疫苗的研發(fā)，值得我們更多關(guān)注和研究。本文就HPV E6/E7mRNA致病的理論基礎(chǔ)、檢測(cè)試劑、臨床應(yīng)用、疫苗方面予以綜述。

一、HPV E6/E7mRNA致病的理論基礎(chǔ)

迄今全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的HPV基因型超過200種[3]，已確定與宮頸癌密切相關(guān)的HR-HPV有15種(16，18，31，45，33，35，39，51，52，56，58，59，68，82，73)。人乳頭瘤病毒的致病機(jī)制與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。HPV屬乳頭瘤空泡病毒，是一種球形無包膜病毒體，其二十面體核衣殼中包含了由7800～7900個(gè)堿基對(duì)組成的雙鏈環(huán)狀DNA，包括早期區(qū)(early region，E區(qū))，晚期區(qū)(late region，L區(qū))，長(zhǎng)調(diào)控區(qū)(long control region，LCR區(qū))。E區(qū)含E6、E7、E1、E2、E4、E5，六個(gè)開放讀碼框(open reading frame，ORFs)，分別編碼E6、E7、E1、E2、E4、E5癌蛋白，早期ORFs影響病毒的感染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯；L區(qū)含L1和L2兩個(gè)開放讀碼框，分別編碼L1、L2結(jié)構(gòu)蛋白，即大、小衣殼蛋白，影響著病毒在細(xì)胞表面的吸附、吞噬、入胞及病毒顆粒的包裝等過程；LCR區(qū)也叫非基因編碼區(qū)，位于L1和E6之間，可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄、影響病毒的致病力，以及調(diào)控蛋白的生成[4]。其中E6和E7 被認(rèn)為是HPV最主要的致病基因。在HPV持續(xù)感染機(jī)體時(shí)，病毒與宿主基因在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生整合，相應(yīng)的啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子被激活，并以整合后的DNA的一條鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA，其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA中以攜帶早期ORFs的多順反子mRNA最為重要，以它為翻譯的直接模板，輔以tRNA 、rRNA等分子，最終在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成E6和E7癌蛋白[5]。E7癌蛋白主要通過結(jié)合并降解pRb蛋白(抑癌基因產(chǎn)物)，促進(jìn)細(xì)胞無限增殖，E6癌蛋白則通過與P53蛋白結(jié)合并促使其降解，阻斷細(xì)胞凋亡[6]。在整個(gè)基因表達(dá)過程中，E6和E7及其上游基因被保留，而大多數(shù)E區(qū)及殼蛋白編碼基因被破壞。其中E2基因的破壞很關(guān)鍵(E2發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的作用)，E2蛋白的失活會(huì)引起E6 和E7基因過度表達(dá)，使得轉(zhuǎn)錄和翻譯持續(xù)不斷地進(jìn)行，癌蛋白大量積累，抑癌基因產(chǎn)物P53和pRb蛋白失活，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控而發(fā)生“永生化”，進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，使病變不可逆[7,8]。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA分子作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即代表著基因整合程度，亦控制著癌蛋白的表達(dá)，是癌基因發(fā)揮作用的重要一環(huán)，其表達(dá)水平的高低與病毒宿主基因整合及感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。大量研究表明，在HR-HPV發(fā)生一過性或早期感染時(shí)，病毒DNA在細(xì)胞核內(nèi)處于游離狀態(tài)，E6/E7mRNA不表達(dá)或低表達(dá)；當(dāng)HR-HPV持續(xù)感染時(shí)，病毒DNA與宿主基因整合，E6/E7被激活，E6/E7mRNA高水平表達(dá)。因此HPV E6/E7 mRNA是病毒基因活躍狀態(tài)的關(guān)鍵性標(biāo)志物，在HPV的致病過程中起著關(guān)鍵的樞紐作用。

二、HPV E6/E7mRNA 檢測(cè)試劑

全球有4種HPV檢測(cè)試劑獲FDA批準(zhǔn)上市，分別為基于雜交捕獲技術(shù)的Hyrid Capture2，基于酶切信號(hào)放大技術(shù)的Cervista HPV，基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的Cobas HPV，以及基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的AptimaTM HPV。前三種屬于第一代檢測(cè)法，都以檢測(cè)HPV DNA為主，但不能反映感染細(xì)胞內(nèi)基因的整合程度及病毒載量。Aptima屬于第二代檢測(cè)法，以檢測(cè)HPV mRNA片段為主，可從基因整合及轉(zhuǎn)錄層面上檢測(cè)病毒活躍狀態(tài)，彌補(bǔ)了第一代檢測(cè)的缺陷[9]。HPV mRNA 二代檢測(cè)法上市僅6年，在美國(guó)和歐洲的應(yīng)用率已不亞于細(xì)胞學(xué)和HPV DNA檢測(cè)法。我國(guó)2015年首次引進(jìn)HPV mRNA檢測(cè)技術(shù)Aptima，目前其應(yīng)用主要集中在大中型城市和地區(qū)醫(yī)院，基層醫(yī)院由于技術(shù)人員、設(shè)備、費(fèi)用等限制，更多的還是依靠細(xì)胞學(xué)和HPV DNA檢測(cè)，且總體上我國(guó)女性對(duì)HPV mRNA檢測(cè)用于宮頸癌篩查和分流的認(rèn)知水平低于液基細(xì)胞學(xué)和HPV DNA，相關(guān)知識(shí)的普及教育是迫切的。

臨床中報(bào)道有關(guān)HPV E6/E7mRNA分子的商品化試劑已有十余種，如Aptima HPV Assay，PreTect HPV-Proofer、Quantivirus及OncoTect 和Nuclisens等，每種試劑的方法都有不同。其中Aptima HPV 采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法及雜交保護(hù)試驗(yàn)對(duì)mRNA進(jìn)行檢測(cè)，可檢出14種HR-HPV E6/E7 mRNA(16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)，大量的研究顯示其對(duì)檢測(cè)≥CIN2病變的特異性和敏感度高達(dá)90%以上。PreTect HPV Proofer是基于核酸序列擴(kuò)增技術(shù)的一種實(shí)時(shí)多重測(cè)定法，使用分子信號(hào)探針進(jìn)行檢測(cè)，可檢出HPV16、18、31、35、45型，Alaghehbandan等臨床研究顯示其在檢測(cè)≥CIN2病變的特異性及敏感度分別為71.6%和74.2%[10]。Quantivirus HPV Assay是基于分支DNA的核酸雜交技術(shù)，可檢測(cè)14種HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，沈勇等研究報(bào)道其在檢測(cè)≥CIN2病變時(shí)的特異性為74.1%、敏感度為58.5%[11]。通過以上及檢索查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，HPV mRNA二代檢測(cè)中除了Aptima檢測(cè)試劑，沒有一個(gè)同時(shí)顯示出高靈敏度和高特異性。正如FASE研究表明Aptima HPV既保留了HPV DNA的敏感性，又具有接近細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的特異性，實(shí)現(xiàn)了敏感性和特異性的良好平衡，且安全性好、操作簡(jiǎn)單，因此而成為所有商品試劑中應(yīng)用最廣的一種[12]。而其它相關(guān)試劑盒雖也經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單，但是對(duì)疾病檢測(cè)的準(zhǔn)確性并沒有如商家所聲稱的那樣高，易造成誤診和漏診，這些試劑如能進(jìn)一步改善技術(shù)和方法提高準(zhǔn)確性，則未來在臨床中可能會(huì)得到更廣的應(yīng)用。

三、HPV E6/E7mRNA的臨床應(yīng)用

宮頸癌篩查有兩大技術(shù)：細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測(cè)，HPV檢測(cè)又分HPV DNA 和HPV mRNA。2016年1月，美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)發(fā)布了最新宮頸癌的篩查和預(yù)防實(shí)踐指南，新指南推薦30～65歲女性行細(xì)胞學(xué)+HPV DNA聯(lián)合篩查，并指出HPV DNA可用于≥25歲女性的初篩，這突顯了HPV DNA篩查的重要地位[13]。HPV DNA的重要性源于其高敏感度和良好的陰性預(yù)測(cè)值，USPSTF研究指出HPV DNA檢測(cè)對(duì)≥CIN2病變的檢測(cè)敏感度比細(xì)胞學(xué)高，敏感度平均增加了35.7%。但HPV DNA也存在缺陷，因?yàn)?0%以上的HPV感染都是一過性的，平均在8～24個(gè)月內(nèi)被機(jī)體清除[14]，檢測(cè)時(shí)會(huì)不可避免的會(huì)包含一過性HPV陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)病毒和宿主基因整合易發(fā)生L1區(qū)的缺失，最終使以L1區(qū)為目標(biāo)的HPV DNA檢測(cè)假陽(yáng)性率高、特異度低。研究顯示HPV DNA的特異度比細(xì)胞學(xué)平均損失了7%，而HPV mRNA檢測(cè)正好可以彌補(bǔ)HPV DNA檢測(cè)的這一缺陷[15]。Monsonego等評(píng)估了HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA和液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在宮頸癌初篩中的應(yīng)用，HPV DNA、HPV E6/E7mRNA、細(xì)胞學(xué)在檢測(cè)≥CIN2以上病變時(shí)的敏感度分別為96.3%、96.3%、74.1%，特異性分別為85.9%、91.0%、91.4%，F(xiàn)ASE研究表明HPV E6/E7mRNA在檢測(cè)≥CIN2以上病變時(shí)的臨床敏感性、陰性預(yù)測(cè)值及篩查間隔與HPV-DNA相似，且特異性更高，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)校正后得出HPV mRNA 比HPV DNA特異性平均提高了5%左右[16]。Haedicke等人發(fā)表的臨床薈萃分析與Monsonego的研究結(jié)果一致，并指出HPV E6/E7mRNA較HPV DNA和細(xì)胞學(xué)能更有效的篩出真正的高危人群(宮頸病變≥CIN2級(jí))，降低過度治療，可在初篩中單獨(dú)應(yīng)用[17]。也有學(xué)者建議，實(shí)施HPV mRNA 和HPV DNA 聯(lián)合篩查，但是考慮費(fèi)用等原因，目前暫不推薦。

篩查出HPV DNA陽(yáng)性患者如何進(jìn)行分流很重要。如果對(duì)所有HPV DNA陽(yáng)性患者進(jìn)行陰道鏡檢查，不但會(huì)造成過度診療，也給患者增加了不必要的心理壓力。細(xì)胞學(xué)為HPV DNA陽(yáng)性分流的常用手段，但是細(xì)胞學(xué)已不是目前唯一的首選分流手段。HPV E6/E7mRNA可從癌基因表達(dá)活躍狀態(tài)層面上分流病毒，不亞于細(xì)胞學(xué)分流，大量臨床研究表明mRNA用于分流HPV DNA 陽(yáng)性患者是可靠且受益的[18]。目前ASCCP和婦科腫瘤學(xué)會(huì)對(duì)HPV mRNA用于HPV陽(yáng)性和或細(xì)胞學(xué)異?；颊叩倪M(jìn)一步分流已達(dá)成共識(shí)[13]。

有報(bào)道HPV E6/E7mRNA可用于宮頸高級(jí)別病變或癌變的治療后監(jiān)測(cè)。趙志強(qiáng)等人研究了HPV mRNA在監(jiān)測(cè)高級(jí)別上皮病變患者宮頸錐切術(shù)后殘留和復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值，文章表明隨訪期間檢測(cè)HPV E6 / E7 mRNA可及時(shí)有效預(yù)測(cè)宮頸病變或癌變術(shù)后CIN殘留和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，減少了過度檢查和治療，但是HPV mRNA僅可作為短期預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)，不適合作為長(zhǎng)期預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)，具體有待更多的大樣本前瞻性研究[19]。

可見HPV E6/E7mRNA在疾病的篩查、分流等方面，比細(xì)胞學(xué)和HPV DNA優(yōu)勢(shì)更大，且其表達(dá)水平的高低可能協(xié)助病變?cè)\斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)。但是由于技術(shù)方法等原因，HPV mRNA、細(xì)胞學(xué)及HPV DNA 檢測(cè)都存在交叉反應(yīng)這一缺點(diǎn)。有報(bào)道在年齡≥30歲的宮頸篩查中，不管何種檢測(cè)，交叉反應(yīng)占到假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的四分之一，具體數(shù)據(jù)仍需要更多的臨床觀察研究。交叉反應(yīng)是必須解決的，因?yàn)樵摷夹g(shù)缺點(diǎn)增加了患者額外費(fèi)用和負(fù)擔(dān)。

四、HPV E6/E7mRNA疫苗展望

HPV疫苗分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗，其中預(yù)防性疫苗的研究應(yīng)用較成熟，主要以HPV L1蛋白聚合形成的類病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體為主[20]。目前有3種預(yù)防性疫苗獲得FDA批準(zhǔn)上市并在全球逐漸應(yīng)用推廣，分別為Gardasil四價(jià)疫苗，Cervarix二價(jià)疫苗，Gradsil九價(jià)疫苗[21]。

相對(duì)于預(yù)防感染，臨床中面臨更多的是已被感染或已病變的患者，因此治療性疫苗的開發(fā)顯得更為迫切。治療性疫苗的類型很多，包括肽類疫苗、病毒載體疫苗、重組蛋白疫苗、DNA疫苗及細(xì)胞相關(guān)疫苗等，主要通過特異性抗原來誘導(dǎo)細(xì)胞、體液免疫反應(yīng)來達(dá)到減滅被感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的目的[22]。由于具體機(jī)制復(fù)雜，目前大多都處于實(shí)驗(yàn)階段或臨床前研究階段。近年來有學(xué)者開始聚焦mRNA分子在疫苗方面的探索，Mleczek等人的研究揭示mRNA抗原具有雙重活性可誘導(dǎo)自適應(yīng)免疫反應(yīng)、效力高和容易修飾等特點(diǎn)，現(xiàn)已有在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等中以mRNA為抗原制備相關(guān)疫苗的研發(fā)，因此有學(xué)者從理論上推測(cè)HPV mRNA在宮頸癌的疫苗及免疫藥物治療方面同樣有價(jià)值[23]。有研究者將DNA和mRNA轉(zhuǎn)染的小鼠樹突細(xì)胞作為針對(duì)HPV16 E7蛋白的潛在疫苗的比較，實(shí)驗(yàn)表明mRNA可使樹突狀細(xì)胞(dendritic cells ，DC)的主要抗原遷移，在用mRNA轉(zhuǎn)染的DC免疫的小鼠中發(fā)現(xiàn)最高頻率的E7特異性CTL，說明了mRNA可增強(qiáng)機(jī)體免疫殺傷反應(yīng)，經(jīng)過mRNA修飾的DCs更有助于對(duì)抗HPV相關(guān)病變[24]。由于目前可檢索到有關(guān)HPV mRNA疫苗方面的文獻(xiàn)研究甚少，具體機(jī)制和可行性有待學(xué)者們的探索。

五、總結(jié)

HPV疫苗和HPV篩查是近十年余宮頸癌防治領(lǐng)域最重要的成就，有望徹底改變宮頸癌高發(fā)病率和死亡率的現(xiàn)狀。HPV E6/E7mRNA是指示病毒基因復(fù)制轉(zhuǎn)錄處于活躍狀態(tài)的分子標(biāo)志物，在準(zhǔn)確性和相關(guān)性方面比HPV DNA和細(xì)胞學(xué)對(duì)病變的指示性更好，顯示了宮頸癌新的篩查前景，有望成為宮頸癌初篩的首選，但這一期望仍需大規(guī)模、多中心、前瞻性的臨床研究來驗(yàn)證。同時(shí)希望未來能有更多基礎(chǔ)研究，為疫苗方面提供思路和方向。

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