內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝纖維化關(guān)系研究進(jìn)展*

潘高峰 綜述，傅茂英，郜玉峰 審校

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是生物細(xì)胞為了抵御外界各種病理刺激所產(chǎn)生的一系列維持自我穩(wěn)態(tài)的病理過程。肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是各種慢性肝病的共同病理過程，持續(xù)HF可進(jìn)展至肝硬化，甚至肝惡性腫瘤，是慢性肝病防治的棘手問題。ERS與多種器官纖維化相關(guān)[1]。目前研究認(rèn)為，ERS可通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)HF相關(guān)因子的表達(dá)等途徑參與HF的發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)。

1 ERS與未折疊蛋白反應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為生物細(xì)胞的重要細(xì)胞器，廣泛參與蛋白質(zhì)及脂酯的轉(zhuǎn)運(yùn)及處理。多種病理刺激可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理細(xì)胞內(nèi)蛋白的能力下降，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白質(zhì)大量聚集及錯(cuò)誤折疊，破壞細(xì)胞原有穩(wěn)態(tài)。ERS是細(xì)胞自我保護(hù)反應(yīng)，為了使細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會啟動、活化一系列信號傳導(dǎo)通路，以處理這些未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白，該過程被稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[2]。未折疊蛋白分子與糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78/Bip）結(jié)合，使得Bip與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種感受蛋白：RNA依賴的蛋白激酶樣激酶-真核翻譯始動因子2-α（protein kinase RNA-like ER kinase-eukaryotic initiation factor2α，PERK-Eif2α）、激活肌醇酶（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）及活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）解離出來，分別激活三條信號通路：（1）PERK-eIF2α 通路：激活的PERK使真核翻譯調(diào)節(jié)因子eIF2α磷酸化，在翻譯水平抑制蛋白質(zhì)合成；（2）IREl-XBPls通路：激活的IREl剪接轉(zhuǎn)錄因子XBPl mRNA，產(chǎn)生活化的XBPls蛋白質(zhì)，后者在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ERS相關(guān)基因的表達(dá)；（3）ATF6通路：激活的 ATF6進(jìn)人細(xì)胞核，可調(diào)節(jié) XBPl、分子伴侶等其他ERS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。若UPR過強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過長則會上調(diào)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白 （CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 12（cysteinyl aspartate specific proteinase-12，caspase-12）的剪切活化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2 HF的主要機(jī)制

HF主要由于肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）特別是間質(zhì)膠原過度沉積所致[3]，其形成過程十分復(fù)雜。目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是各種促HF因素作用的最終靶點(diǎn)。此外，細(xì)胞因子的參與、微小RNA異常表達(dá)、遺傳因素、腸道菌群紊亂以及免疫細(xì)胞等也與HF相關(guān)。

2.1 HSC與HF 正常靜息狀態(tài)下，HSC很少產(chǎn)生ECM。炎癥、損傷等刺激可使HSC活化。活化的HSC除了可以合成并分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型、III型膠原蛋白外，還可直接分化為肌成纖維細(xì)胞（myofiborblast，MFB），最終促進(jìn) HF 的形成。目前認(rèn)為[4～9]，轉(zhuǎn)化生長因子β1/smad（TGFβ1/smad）通路、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）通路、瘦素（leptin）通路、ROS-mediated ERK/JNK s通路、整合素（integrin）通路及Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等參與了HSC的活化。另外，當(dāng)HSC凋亡相對不足時(shí)，也可促進(jìn)HF的形成。

2.2 細(xì)胞因子與HF報(bào)道認(rèn)為：血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）可通過激活 HSC 參與HF的形成及發(fā)展[10]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）一直被認(rèn)為是一個(gè)重要的促HF因子。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growing factor，CTGF）是一個(gè)重要的促HF因素，可通過抑制其來抑制HSC的激活來預(yù)防 HF 的發(fā)生[11]。此外[12]，IL-10、IL-15、IL-17、IL-20、IL-22與HF的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。

2.3 微小RNA與HF 微小RNA是近些年研究熱點(diǎn)。它是一個(gè)內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其可在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進(jìn)行調(diào)控[13]。在HF病程中，多種微小RNA與HSC的激活相關(guān)。微小RNA既可促進(jìn)HF的發(fā)生發(fā)展，也可抑制HF的發(fā)生發(fā)展。例如，micro-21可通過多種途徑促進(jìn)HF發(fā)生發(fā)展[14]，而micro-15b、micro-16及micro-29可抑制HF的發(fā)生發(fā)展[15，16]。

2.4 遺傳與HF遺傳因素也參與了慢性肝病的發(fā)生發(fā)展。目前認(rèn)為基因的多態(tài)性可以從多個(gè)方面影響HF的發(fā)生發(fā)展[17]?；虻亩鄳B(tài)性可從疾病易感性，免疫及炎癥反應(yīng)，損傷及修復(fù)機(jī)制以及損傷后基質(zhì)重建等方面對HF的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響[18]。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，慢性乙型肝炎患者血清中IL-10水平有差異，那些基因多態(tài)性592號堿基缺失的患者更易被HBV感染，并產(chǎn)生包括HF在內(nèi)的疾病進(jìn)展。此外，CXXL10、CD24/CollA1以及血管緊張素原等基因的多態(tài)性也影響著慢性乙型肝炎的預(yù)后。鑒于種族差異，這種等位基因的多態(tài)性分布及頻率也會不同，故我國HF與基因多態(tài)性的關(guān)系不能照搬國外，仍需大規(guī)模臨床試驗(yàn)及基因組研究來探索。

2.5 腸道菌群紊亂與HF 目前研究認(rèn)為，腸道菌群與人體的多種病理生理過程相關(guān)。正常的腸道菌群有益于機(jī)體的健康，但紊亂的腸道菌群可導(dǎo)致及加重一些疾病[20]。腸道菌群紊亂與HF發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21]，前者可促進(jìn)后者的發(fā)生發(fā)展，后者亦可使前者加重。機(jī)體一旦發(fā)生腸道菌群紊亂，藥物的代謝、維生素的合成等功能會減退，可加重肝細(xì)胞損害，同時(shí)腸道粘膜屏障的破壞可致肝細(xì)胞凋亡壞死，最終促進(jìn)HF的發(fā)生發(fā)展[22，23]。另外，腸道菌群紊亂可促進(jìn)一些炎癥因子的釋放，而炎癥因子又可導(dǎo)致HSC的活化及增值。故腸道菌群紊亂間接參與了HF的形成。

3 ERS與HF

3.1 ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與HF目前認(rèn)為，ERS與病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、中毒性肝損傷、肝衰竭等多種肝臟疾病密切相關(guān)[24]。a1抗胰蛋白酶缺乏者因大量突變的a1抗胰蛋白酶在肝細(xì)胞內(nèi)聚集而誘發(fā)ERS，最終引起肝臟疾病。研究表明[25]：在a1抗胰蛋白酶突變的轉(zhuǎn)基因小鼠HF模型中，ERS相關(guān)蛋白BIP、CHOP的表達(dá)與HF密切相關(guān)。CHOP蛋白可能通過上調(diào)促纖維化因子aSMA、TGF及膠原蛋白的表達(dá)導(dǎo)致HF[25，26]。也有報(bào)道認(rèn)為[1]，ERS促進(jìn)了基因突變及損傷模型中HF進(jìn)展，其中CHOP蛋白可能通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的存活發(fā)揮重要作用。藥物誘導(dǎo)的ERS在體內(nèi)及體外均可促進(jìn)HSC的凋亡，從而抑制HF的形成[27]。CCl4誘導(dǎo)大鼠HF模型中，ERS相關(guān)分子Tribbles同源蛋白3（tribbles homolog 3，TRB3）和CHOP在蛋白及mRNA表達(dá)水平均增加，其變化趨勢與大鼠肝細(xì)胞凋亡率一致，提示ERS可能通過TRB3和CHOP促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，參與HF發(fā)生發(fā)展。作為C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，CHOP可通過下調(diào)抗凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。推測CHOP蛋白可通過促進(jìn)HSC的凋亡來抑制HF的發(fā)生發(fā)展。

Caspase-12是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個(gè)主要調(diào)節(jié)因子。研究表明，caspase-12通路與膽汁淤積性HF發(fā)展密切相關(guān)。在非酒精性脂肪肝模型中，阻斷ERS的caspase-12通路有助于非酒精性HF的恢復(fù)[28]。CCL4誘導(dǎo)大鼠HF模型中，ERS標(biāo)志性蛋白Caspase-12可能與HF的發(fā)生、發(fā)展和恢復(fù)逆轉(zhuǎn)密切相關(guān)[29]。有報(bào)道指出[30]，ERS在HF的進(jìn)展期抑制HSC活化，在HF逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期促進(jìn)活化的HSC凋亡。因此，caspase-12可通過調(diào)節(jié)HSC凋亡來參與HF的發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)。

目前認(rèn)為[31]，咖啡因具有抗HF作用，而咖啡因可能通過調(diào)節(jié)HSC的凋亡來發(fā)揮抗HF作用[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[33]，咖啡因可通過ERS的IREl通路來促進(jìn)HSC的凋亡從而發(fā)揮抗HF作用。

3.2 ERS通過細(xì)胞因子及活性氧簇參與HFERS與諸多細(xì)胞因子存在密切聯(lián)系，HF的發(fā)生發(fā)展與 TGFβ、PDGF、TNF-α、CTGF、IL-10、IL-15、IL-20、NF-κB 等多種細(xì)胞因子相關(guān)。UPR誘導(dǎo)的凋亡可以導(dǎo)致TGF-β的釋放，進(jìn)而刺激HF的發(fā)生發(fā)展。故ERS可通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來參與HF的病程。ERS與活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）密切相關(guān)，二者可互相促進(jìn)，而ROS在誘導(dǎo)肝損傷及HF中發(fā)揮著重要的作用[34]，因而ERS可通過ROS介導(dǎo)HF的發(fā)生發(fā)展。

3.3 MANF與HF中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）基因是有從數(shù)千個(gè)基因中篩選出來的并對ERS最敏感的基因，其編碼的MANF蛋白為分泌性蛋白。MANF在慢性乙型病毒性肝炎、腦缺血、心肌缺血再灌注等疾病中具有細(xì)胞保護(hù)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)[35]，慢性HBV感染者HF的進(jìn)展與其外周血中MANF m RNA水平正相關(guān)。針對慢性HBV感染者外周血MANF蛋白研究發(fā)現(xiàn)[36]，乙型肝炎肝硬化組MANF蛋白表達(dá)水平較正常對照組及慢性HBV攜帶組低，推測MANF蛋白下降可能通過某種機(jī)制參與了乙型肝炎肝硬化的病程；乙型肝炎表面抗原＞20000IU/ml組MANF蛋白表達(dá)水平低于乙型肝炎表面抗原＜15000IU/m l組。目前普遍認(rèn)為，乙型肝炎表面抗原水平越低的患者肝硬化程度越重，這與上述外周血MANF m RNA水平研究結(jié)果一致。因此推測，MANF蛋白在HF早期適度的ERS中起著肝臟保護(hù)作用。然而，ERS相關(guān)蛋白MANF與HF的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

3.4 ERS信號通路相關(guān)因子與HF 前期研究發(fā)現(xiàn)[37]，與正常健康對照組相比，慢性無癥狀HBV攜帶組、慢性乙型肝炎組及乙型肝炎肝硬化組外周血中GRP78 mRNA及 XBP1 mRNA水平均升高。其中，乙型肝炎肝硬化組上述兩個(gè)ERS相關(guān)指標(biāo)mRNA水平與慢性無癥狀HBV攜帶組及慢性乙型肝炎組比較均有下降趨勢，推測ERS參與了乙型肝炎肝硬化病程。經(jīng)奧曲肽皮下注射處理后的大鼠HF程度低,同時(shí)該組大鼠血清中的GRP78及XBP1蛋白水平亦低，而GRP78與XBP1又是ERS相關(guān)蛋白，故奧曲肽可能通過減輕肝臟的ERS反應(yīng)來緩解HF[38]。肝臟組織勻漿中丙二醛高水平表達(dá)提示存在氧化應(yīng)激。在小鼠肝硬化形成過程中，GRP78表達(dá)水平與丙二醛表達(dá)水平正相關(guān)[39]。前者為ERS相關(guān)蛋白，后者代表著氧化應(yīng)激，提示ERS可能通過氧化應(yīng)激參與HF病程。研究認(rèn)為[40]，血清鐵可通過激活HSC促進(jìn)HF發(fā)生發(fā)展，而瞬時(shí)敲出GRP78基因后血清鐵促HF作用減弱。推測，血清鐵可能通過ERS相關(guān)蛋白GRP78來發(fā)揮促HF作用。研究認(rèn)為[41]，抑制IRE1α-XBP1信號通路可降低HSC活化及自噬來抑制HF。Piskounova[42]et al研究提示，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinam-ide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOXs）參與了 HF 的發(fā)生及發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[43]，NOXs在HF中促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而介導(dǎo)UPR中IRE1α-XBP1信號通路的激活及ERS的發(fā)生。因而，IRE1α-XBP1信號通路參與了HF的病理生理過程。也有研究指出[44]，發(fā)生在HSC中的ERS可通過PERK介導(dǎo)的核內(nèi)不均一性核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1，hnRNP A1）下調(diào)及 SMAD2 上調(diào)來促進(jìn)HF的發(fā)生發(fā)展。綜上所訴，ERS信號通路中相關(guān)因子 GRP78、XBP1、IRE1α 及 PERK參與了 HF的病理過程，但他們參與HF的具體機(jī)制尚有待深入研究。

3.5 ERS通過微小RNA參與HF目前研究認(rèn)為[45，46]，ERS可通過與微小RNA之間的相互作用參與一些病理生理過程。Upton[47]et al提出XBP1是激活微小RNA-346表達(dá)的關(guān)鍵因素，而后者在控制炎癥方面發(fā)揮重要作用。故推測ERS相關(guān)蛋白XBP1可通過激活微小RNA-346來控制肝臟的炎癥，從而間接抑制HF的形成及發(fā)展。有報(bào)道指出[48]，ERS介導(dǎo)的微小RNA-30C-2*的表達(dá)直接參與了PERK通路對NF-κB的激活。而NF-κB與HF密切相關(guān)，故ERS可借助于微小RNA-30C-2*間接參與HF的發(fā)生發(fā)展。也有研究認(rèn)為[49]：ERS可通過IRE1a調(diào)節(jié)微小RNA-150的降解及XBP1的剪切來促進(jìn)纖維化形成，抑制IRE1 RNA酶可阻礙HSC直接轉(zhuǎn)化為纖維母細(xì)胞從而緩解HF。針對膽道梗阻小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)[46]，微小RNA-29a過度表達(dá)可緩解膽道梗阻所致ERS而發(fā)揮抗HF作用。因此認(rèn)為，ERS與部分微小RNA相互作用參與HF的發(fā)生發(fā)展。

4 展望

HF是一個(gè)由多種肝臟細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號通路等參與的復(fù)雜病理過程。ERS作為一條重要的信號傳導(dǎo)通路與諸多疾病密切相關(guān)。本文闡述了ERS與HF發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)的關(guān)系，有助于進(jìn)一步豐富HF機(jī)制，未來通過深入研究，ERS有望成為一個(gè)新的切入點(diǎn)，藉此尋找HF預(yù)防、診療及預(yù)后評估等新的靶點(diǎn)。