乳鐵蛋白生物學(xué)功能及其檢測方法研究進(jìn)展

肖奕昕，趙善倉,董燕婕，李增梅，李曉雪，鄧立剛，李霞，丁蕊艷，張樹秋，李大鵬

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實驗室，山東泰安271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實驗室，濟(jì)南250100）

0 引言

乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡稱LF)是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，其分子量約為80 ku[1]。1939年，Sorensen M等首次從牛乳中分離出來[2]；1960年，Johansson等首次從人乳中分離出來[3]；1961年，Blanche等從人乳中分離并命名為乳鐵蛋白[4]。許多其他哺乳動物分泌物中也含有乳鐵蛋白[5]。乳鐵蛋白具有廣譜抗菌性，調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡，抑制腫瘤細(xì)胞生長等[6]生物活性，在《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，被列為一種新型營養(yǎng)強(qiáng)化劑。目前，乳鐵蛋白主要檢測方法有高效液相色譜法[7]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、聚丙烯酰胺凝膠電泳法[9]、分光光度法[10]、酶聯(lián)免疫吸附法[11]等，但其檢測方法依然是限制研究深入的主要技術(shù)瓶頸。本文綜述了乳鐵蛋白的功能及其檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并對該領(lǐng)域發(fā)展趨勢予以展望。

1 乳鐵蛋白的功能

乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合型糖蛋白，大約由700個氨基酸組成，其分子量為80 ku。人、鼠、牛、馬、豬、山羊、綿羊、水牛和駱駝乳，這9種哺乳動物的乳鐵蛋白具有高度的同源性，其中有兩個顯著的共同特征：(1)內(nèi)部序列的兩倍重疊；(2)高pH的堿性特征[12]。

乳鐵蛋白僅包含一條多肽鏈，折疊成兩個基本對稱且高度同源的球狀葉結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)“二枚銀杏葉型”結(jié)構(gòu)。兩個葉片的同源性可達(dá)33%～41%，一端是氨基末端(N-葉)，一端是羧基末端葉(C-葉)，1–332號氨基酸組成N-葉，344-703號氨基酸組成C-葉，在人類乳鐵蛋白中，兩個葉之間由鉸鏈區(qū)相連接，鉸鏈區(qū)為由乳鐵蛋白的333號氨基酸到343號氨基酸所組成，以α-螺旋的形式存在，在乳鐵蛋白的構(gòu)想變化中起到紐帶作用。每個葉包含一個鐵結(jié)合位點(diǎn)，都能高親和性地可逆的與鐵結(jié)合。一個鐵離子可與乳鐵蛋白的4個氨基酸殘基相連：2個酪氨酸、1個天冬氨酸、1個組氨酸相連。乳鐵蛋白與鐵離子結(jié)合之前，球狀結(jié)構(gòu)可隨意伸展，鐵離子結(jié)合到乳鐵蛋白后會引起后者的構(gòu)象變化，即使乳鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)更加緊密。鐵進(jìn)入每葉敞開的縫隙內(nèi)部，然后此區(qū)域再相應(yīng)閉合[13]。乳鐵蛋白有α、β、γ三種異構(gòu)形式，三者具有相同的理化性質(zhì)及抗原性質(zhì)[14]。許多研究表明，乳鐵蛋白具有增強(qiáng)機(jī)體抗菌抗病毒能力[15]，體內(nèi)鐵的代謝[16]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[17]，抗癌及抗氧化的功能[18]。

1.1 抗菌性

大量的體內(nèi)、體外實驗證明，乳鐵蛋白具有廣譜的抗菌性，抗革蘭氏陰性菌、抗革蘭氏陽性菌以及耐酸耐乙醇菌如結(jié)核桿菌等[13]。乳鐵蛋白在酸性條件環(huán)境下通過胃蛋白酶的作用，釋放出抗菌肽，牛乳鐵蛋白肽B(Lacto ferricin B)f18-36和乳鐵蛋白肽(Lacto ferram pin)f268-284，具有廣譜抗菌性，對熱和pH穩(wěn)定，其抗菌的方式為殺菌。乳鐵蛋白及其衍生物的抗菌特性主要是由于3個作用機(jī)制：(1)高度的鐵結(jié)合能力，乳鐵蛋白通過螯合鐵離子以及靜電結(jié)合鐵離子與細(xì)菌競爭結(jié)合鐵，從而抑制微生物的生長；(2)乳鐵蛋白直接結(jié)合到微生物膜上，尤其是結(jié)合到革蘭氏陰性菌的脂多糖上，造成外膜結(jié)構(gòu)損傷和抑制病毒的復(fù)制；(3)阻止微生物附著在上皮細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞上。同時，Suzanne[19]等發(fā)現(xiàn)，在有IgA和溶菌酶存在的情況下，乳鐵蛋白的抗微生物感染能力會增強(qiáng)。

1.2 抗病毒性

乳鐵蛋白能夠抵抗許多病毒的感染，對感染人類和動物的RNA和DNA病毒具有廣譜抗性，具有對呼吸道合胞病毒(RSV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(HCM V)、漢坦病毒抗性作用。乳鐵蛋白濃度低于人乳乳鐵蛋白濃度10倍時，能有效抑制人類呼吸道合胞病毒(RSV)，還能有效抑制無包膜的病毒如腺病毒和腸道病毒[20]。人類免疫缺陷病毒(HIV)仍然是一個重大的醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)，因為目前對其癥狀的治療并不完全有效。體外研究表明，在人血漿和乳中，乳鐵蛋白抑制病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制從而抑制HIV的活性[21]。Wang[22]等發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白能顯著抑制人類免疫缺陷病毒1型逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-1RT)的活性，其半抑制濃度(IC 50)為6μmol/L。Andersen[23]等研究表明，不同乳鐵蛋白和N端多肽(Lactoferricin)可以抑制抗巨細(xì)胞病毒(HCM V)早期和晚期抗原表達(dá)，同時抑制HCM V產(chǎn)生感染性病毒子代。Murphy[24]等在病毒感染前用400μg/m L乳鐵蛋白在37℃處理細(xì)胞1小時，將與處理后的細(xì)胞共培養(yǎng)48小時，乳鐵蛋白處理過的細(xì)胞中漢坦病毒的病毒灶僅有對照的15%，研究表明乳鐵蛋白具有抑制漢坦病毒的作用。Shin[25]等人，通過給被流感病毒感染的小鼠個體口服0.06 g乳鐵蛋白，發(fā)現(xiàn)緩解了其炎癥癥狀。乳鐵蛋白抗病毒作用的發(fā)生機(jī)制主要包括：(1)通過直接與病毒或病毒粒子結(jié)合，抑制病毒吸附和入侵靶細(xì)胞。(2)乳鐵蛋白與靶細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，阻斷病毒和靶細(xì)胞結(jié)合，阻止病毒對宿主細(xì)胞的感染。(3)乳鐵蛋白通過抑制部分病毒，如輪狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒感染細(xì)胞后的病毒復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用。(4)通過調(diào)節(jié)病毒等病原體引起的炎癥反應(yīng)和上調(diào)機(jī)體免疫系統(tǒng)，通過增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK cell)的細(xì)胞毒作用提高機(jī)體抗病毒反應(yīng)，間接達(dá)到抗病毒目的。

1.3 參與體內(nèi)鐵代謝

乳鐵蛋白在維持細(xì)胞的鐵離子水平起到至關(guān)重要的作用。來自血清的運(yùn)鐵蛋白(T f)與乳鐵蛋白（Lf）晶體結(jié)構(gòu)、鐵結(jié)合位點(diǎn)很相似。在生理pH下，乳鐵蛋白與鐵生成復(fù)合物的生成常數(shù)是運(yùn)鐵蛋白的260倍，而從LF-Fe復(fù)合物中去除鐵的速度比T f-Fe慢100倍，在酸性條件下，T f幾乎喪失了鐵結(jié)合能力。Kaw akam i[26]等研究發(fā)現(xiàn)人、兔、豬等小腸黏膜細(xì)胞表面有特殊的乳鐵蛋白受體(乳鐵蛋白-R)，當(dāng)乳鐵蛋白到達(dá)腸道后，立即與該受體起反應(yīng)，然后乳鐵蛋白-R進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，釋放出Fe+3，這種特殊的乳鐵蛋白受體可以提離鐵的吸收率。貧血性疾病患者通常是體內(nèi)缺少鐵元素而導(dǎo)致貧血癥狀的產(chǎn)生，普通的口服補(bǔ)鐵劑對粘膜會產(chǎn)生一定刺激，對腸胃系統(tǒng)存在較大副作用，且補(bǔ)鐵效率較低，乳鐵蛋白能夠降低有效鐵的使用量，可提高腸細(xì)胞對鐵的生物可用性，同時也可以降低鐵攝入過多的影響[27]。

1.4 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫

乳鐵蛋白是一種天然的有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)劑，LF對先天及獲得性免疫系統(tǒng)均有調(diào)節(jié)作用。LF存在于中性粒細(xì)胞的繼發(fā)性顆粒中，是宿主防御第一道防線的主要組成部分。Wa kabayashi等[28]應(yīng)用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測小鼠腸道20個免疫相關(guān)基因，在乳鐵蛋白濃度為2.5 g/kg時，對這些基因的表達(dá)產(chǎn)生特異性和非特異性的影響。LF的正電荷使其可與免疫系統(tǒng)中表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞結(jié)合，激活信號通路，引起細(xì)胞反應(yīng)[29]。通過抑制促炎性細(xì)胞因子(如γ-干擾素，α-腫瘤壞死因子，白介素-1β、2、6)，發(fā)揮抗炎活性；促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞增生，增加血液中多形核細(xì)胞的數(shù)量，誘導(dǎo)吞噬作用；還可調(diào)節(jié)腸細(xì)胞及腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)產(chǎn)生細(xì)胞因子，并促使細(xì)胞因子進(jìn)入體循環(huán)作用于白細(xì)胞[17]。

1.5 抗癌作用

乳鐵蛋白能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖，但對癌細(xì)胞卻是起阻止而非刺激作用。研究表明，乳鐵蛋白具有阻礙體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)化，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，主要是因為乳鐵蛋白能誘導(dǎo)改變細(xì)胞周期中一些重要調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平或活性，其他一些體內(nèi)研究認(rèn)為，乳鐵蛋白抗腫瘤作用也可能通過激活腫瘤細(xì)胞中FAS信號途徑，或利用一些乳鐵蛋白異構(gòu)體所具有的DNA酶、RNA酶及ATP酶活性等，產(chǎn)生細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。乳鐵蛋白具有刺激抗腫瘤免疫的功能，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增加免疫細(xì)胞的數(shù)量以及增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性而提高宿主防御腫瘤的能力[30]。Jeffrey[31]等研究發(fā)現(xiàn)，人乳鐵蛋白通過阻斷細(xì)胞從G 0到G 1期的轉(zhuǎn)化從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。另外乳鐵蛋白可直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗血管生成的作用[32]。

1.6 抗氧化作用

乳鐵蛋白主要通過螯合Fe3+，減少羥自由基和DPPH自由基的產(chǎn)生，具有抗氧化作用[33]。另外乳鐵蛋白可以抑制硫代巴比妥酸(TBA)和丙二醛(M DA)的生成[34]。非飽和乳鐵蛋白可以隔離自由鐵，保護(hù)糖蛋白不被氧化劑氧化。乳鐵蛋白的抗氧化活性與磷脂體系、緩沖條件、金屬離子的存在等具有一定關(guān)系。另外，乳鐵蛋白具有的核糖核酸酶活性，能通過降解酵母tRNA抑制超氧離子形成，從而降低人體內(nèi)自由基對動脈血管壁彈性蛋白的破壞，達(dá)到預(yù)防和治療動脈粥樣硬化和冠心病的目的。

2 乳鐵蛋白檢測方法

乳鐵蛋白作為一種蛋白質(zhì)，各種蛋白含量的常規(guī)分析方法都適用于其分析定量。目前來說，檢測乳鐵蛋白的分析方法主要分為理化分析法、免疫分析法、生物電化學(xué)法和表面等離子共振技術(shù)(SPR)等。

2.1 理化分析法

2.1.1 反相高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)的原理是在色譜柱中，各組分依照分配系數(shù)、吸附力大小等差異而被分離，并被檢測器檢出[35]。反相高效液相色譜(RP-HPLC)是HPLC中應(yīng)用最為廣泛的一種液相色譜法。RP-HPLC是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系。

王德偉[7]等用pH 4.6的醋酸鹽緩沖液溶解分離乳粉中乳鐵蛋白，用C 18色譜柱快速分離，在10～500m g/L之間呈現(xiàn)良好的線性(R2=0.9999)，平均回收率為98.0%。夏明[35]等用無水乙醇使乳鐵蛋白等沉淀，再用醋酸鹽溶液除去酪蛋白，使用三氟乙酸及甲醇作為流動相，乳鐵蛋白檢測的線性范圍是0.4～2m g/m L(R2=0.9980)，平均回收率95.4%。E.Tsakali[36]等使用乙腈水三氟乙酸作為流動相，乳鐵蛋白檢出線性范圍為50～1 200μg/m L(R2=0.99)。

反相高效液相色譜法測定的結(jié)果準(zhǔn)確，檢測速度快易操作，實驗再現(xiàn)性良好。但該方法對樣品的純度要求較高，當(dāng)檢測樣品純度較低時，由于乳鐵蛋白與其他蛋白分子量相接近，使得在色譜柱上保留時間相近，各組分不易分離開，從而影響定量結(jié)果，因此適用于高純度的樣品測定。另外高效液相色譜所使用的流動相為乙腈，對環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。樣品前處理依然是限制液相色譜法檢測乳鐵蛋白的關(guān)鍵因素。利用液相色譜法檢測目前常用的前處理方法是利用肝素親和柱進(jìn)行前處理的方法[37]，采用肝素親和柱對樣品進(jìn)行前處理能夠較好的分離和純化生鮮牛乳中的乳鐵蛋白，但是肝素親和柱不適用于生鮮羊乳等其他特色乳中乳鐵蛋白的分離純化，仍含有其他種類的蛋白干擾檢測。同時肝素親和柱價格昂貴，且重復(fù)利用次數(shù)較少。

2.1.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

質(zhì)譜儀是能夠測量真空中離子的質(zhì)核比(m/z)的一種儀器。根據(jù)質(zhì)核比可以準(zhǔn)確的確定待測物質(zhì)的分子質(zhì)量，從而確定其分子組成。蛋白質(zhì)組中分析樣品通常是某蛋白樣品經(jīng)胰蛋白酶或類似消化產(chǎn)生肽段的混合物，可以通過確定某蛋白的特異性肽段來定量該蛋白。

Zhang[8]等用堿性胰蛋白酶將牛乳鐵蛋白酶切為肽段，確定乳鐵蛋白的特異性肽段，用穩(wěn)定同位素肽段作為內(nèi)標(biāo)，將蛋白質(zhì)組學(xué)的酶解技術(shù)與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，檢測各種乳與乳制品中乳鐵蛋白含量。該方法最低定量限為1.5 m g/kg，回收率在93.2%～107.3%間。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有良好的回收率和重復(fù)性，準(zhǔn)確度高，能夠滿足不同樣品中的乳鐵蛋白檢測要求，可以同時對變性和非變性乳鐵蛋白進(jìn)行定量檢測。前處理方法較為簡便，基質(zhì)效應(yīng)會干擾質(zhì)譜定量檢測的準(zhǔn)確度，可以通過使用內(nèi)標(biāo)的方法，降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果造成的影響。但是該方法所需要儀器較為昂貴，對特異性肽段的篩選也較為復(fù)雜，另外篩選出的特異性肽段，需要通過生物合成該特異性肽段作為標(biāo)準(zhǔn)品，合成過程較為復(fù)雜，操作難度大，需要操作人員具有較高的專業(yè)知識。

2.1.3 高效毛細(xì)管電泳分析法

高效毛細(xì)管電泳分析法(HPCE)[38]有很強(qiáng)大的分離能力，毛細(xì)管的分離柱效會隨著分離樣品分子的擴(kuò)散系數(shù)減小而上升，蛋白質(zhì)、肽類等生物大分子具有擴(kuò)散系數(shù)小的特點(diǎn)，因此采用該法可以較好地分離及檢測乳鐵蛋白。陳永艷[39]等采用醋酸沉淀干擾蛋白質(zhì)，離心后取上清液稀釋十倍，以57 cm×50μm i.d.毛細(xì)管分離檢測樣品中乳鐵蛋白，乳鐵蛋白濃度在50-800 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈較為良好線性關(guān)系，檢出限和定量限分別為15 m g/L和50 m g/L。許寧[40]采用67 cm×50μm i.d.毛細(xì)管，HPCE的毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式分離測定牛乳鐵蛋白，乳鐵蛋白進(jìn)樣濃度在100.0～600.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.9995)，其最低檢測限為25 mg/L。劉宇[41]等采用80cm×50μm i.d.未涂層石英毛細(xì)管柱，用各濃度為三羥甲基氨基甲烷200 mm o l/L，戊二胺60 mm o l/L，十六烷基溴化銨120 mm ol/L，聚乙二醇80 mm ol/L作動態(tài)涂層，分離檢測乳鐵蛋白，其線性范圍為0.625～10 g/L，線性關(guān)系良好(r2=0.9996)。

高效毛細(xì)管電泳法測定乳鐵蛋白含量具有前處理簡單、分離效率高、分析速度快、操作簡便、操作成本低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法僅適用于嬰幼兒配方奶粉、保健食品中乳鐵蛋白的測定，但該方法對于生乳中的乳鐵蛋白測定效果不佳，其前處理無法除去生乳中其他雜質(zhì)對于乳鐵蛋白測定的干擾。

2.1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE電泳)是蛋白質(zhì)分析中常用方法之一。SDS-PAGE是根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異以及分子質(zhì)量大小不同，產(chǎn)生不同的遷移率，從而將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶。該方法對于乳鐵蛋白的分離效果較好。李珊珊[9]等采用凝膠電泳法檢測定乳及乳制品中乳鐵蛋白含量，結(jié)果表明用該分離方法檢測的不同乳及乳制品中的乳鐵蛋白含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，且測得的含量均高于其檢出限和定量限。邢志恩[42]等通過SDS-PAGE電泳分離乳清蛋白，薄層掃描法定量不同來源乳中乳鐵蛋白含量，乳鐵蛋白加標(biāo)回收率分別為104.53%、108.37%，同板精密度RSD值為3.10%和1.82%，在100～2 000μg/m L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9988和0.9990。

SDS-PAGE電泳法測定乳鐵蛋白含量其實驗結(jié)果準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好，不需復(fù)雜的前處理，靈敏度高，無需大量使用溶劑，但該方法每次檢測的樣品數(shù)量有限，配制凝膠、電泳以及染色脫色所需要的時間較長，前處理提純?nèi)殍F蛋白較為粗糙，未除去的蛋白等會對結(jié)果造成一定影響。另外，配制凝膠時使用的聚丙烯酰胺等物質(zhì)對人體產(chǎn)生有害影響，可作為初步定量乳及乳制品中乳鐵蛋白的方法。

2.1.5 分光光度法

分光光度法(Spectrophotometry)是指通過檢測特定波長或波長區(qū)間內(nèi)被測物質(zhì)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對該物質(zhì)進(jìn)行分析的方法[10]。

盧蓉蓉等[43]采用純度為90%的乳鐵蛋白溶液，在400-700 nm波長下進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白在475 nm處有特征吸收峰，通過475nm處吸光度的不同來計算乳鐵蛋白的含量。夏明[44]等通過對原分光光度法的改進(jìn)，對嬰幼兒奶粉中的乳鐵蛋白進(jìn)行檢測，首先加入二價鐵離子使乳鐵蛋白中的鐵達(dá)到飽和以獲得穩(wěn)定的鐵含量，然后對蛋白反復(fù)醇沉和水溶以除去游離鐵，再用原子吸收分光光度計測定鐵含量，依據(jù)鐵與蛋白含量的相互關(guān)系計算出乳鐵蛋白含量。其加樣回收率超過96%，檢測范圍為3.5～100m g/g。

分光光度法具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，可以快速的測定出乳鐵蛋白的含量，對儀器設(shè)備的要求不高，操作簡便，適合于工廠中乳鐵蛋白分離純化過程中的快速檢測，由于其檢測的準(zhǔn)確度不高，不適用于生鮮乳、嬰兒配方乳粉等乳及乳制品中乳鐵蛋白含量的精確測定。

2.2 免疫分析法

2.2.1 放射免疫擴(kuò)散法

放射免疫擴(kuò)散法(Radial Immunodiffusion)是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)的方法，研究機(jī)體對抗原物質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化規(guī)律。

龔廣宇[45]等將乳鐵蛋白抗原混入瓊脂糖中，傾入平板中，待瓊脂糖凝結(jié)后打孔，接入乳鐵蛋白樣品，乳鐵蛋白抗原呈放射形擴(kuò)散，在以小孔為中心的環(huán)狀區(qū)域形成抗原—抗體反應(yīng)沉淀帶，該沉淀帶被R ID染色液染色，沉淀帶環(huán)的直徑與抗體乳鐵蛋白的濃度成正比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計算出乳鐵蛋白含量，適用于嬰兒配方奶粉的測定。

該方法雖操作較為簡便，但是時間耗費(fèi)較長，影響因素較多且復(fù)雜，檢測范圍有限，檢測準(zhǔn)確度不高，容易產(chǎn)生較大的誤差，該方法的適用范圍比較窄，僅適用于嬰兒配方奶粉的測定，在實際操作中基本不采用該方法測定乳鐵蛋白含量。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種新型、快速、準(zhǔn)確的免疫學(xué)分析技術(shù)。

張英華[11]等應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定牛乳鐵蛋白的含量，其檢測的線性范圍為0.8～100 ng/m L，最低檢出量為0.5 ng/m L。盧蓉蓉等[43]應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定初乳中乳鐵蛋白的含量，線性范圍為3.1～200 ng/m L，最低檢測限為1.5 ng/m L，回收率在91.82%～115.56%之間，變異系數(shù)在6.20%～9.18%之間。

酶聯(lián)免疫法能夠快速檢測出乳鐵蛋白含量，操作較為簡便，而且能夠同時對幾十個甚至幾百個試樣進(jìn)行檢測，是一種較為理想的檢測乳鐵蛋白的方法，但是該方法在使用時，對待測樣品應(yīng)進(jìn)行逐級稀釋，較為繁瑣，容易帶來誤差，另外所采用的試劑盒價錢較為昂貴。

2.2.3 膠體金標(biāo)記法

膠體金是利用氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，在靜電作用下形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。把抗乳鐵蛋白抗體標(biāo)記在膠體金顆粒表面，形成金探針，金探針與乳鐵蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，特異性結(jié)合產(chǎn)物可用分光光度計進(jìn)行檢測。

李巖[46]等采用膠體金標(biāo)記法檢測乳鐵蛋白，得出最佳檢測條件即檢測波長為630 nm；金探針最佳濃度為1∶2；最佳pH值為7.4；稀釋液中BSA的濃度為15 ug/m L；最佳檢測溫度為25℃；作用時間段為0-20 m in。結(jié)果表明：該法敏感性高，檢測范圍10-2 500 ng/m L，回收率95.89%，批內(nèi)變異系數(shù)CV%=3.57%，批間CV%=4.74%。

膠體金法使用較少的標(biāo)記物和樣本，實驗一步完成，很大程度上縮短分析時間，但實驗容易受外界因素影響較大，會影響其靈敏度及檢測限。

2.3 生物電化學(xué)法

循環(huán)伏安法(cyclic vo ltamm etry，CV)也稱為線性變位循環(huán)伏安法，是一種最常用的動態(tài)電化學(xué)技術(shù)。通過記錄電流隨電位變化的曲線就可得到循環(huán)伏安圖像。交流阻抗法(Electrochem ical Im pedance Spectroscopic)是一種以小振幅的正弦波電位(或電流)為信號擾動電解池，通過計算電極的電化學(xué)參數(shù)而進(jìn)行檢測的電化學(xué)測量方法。

曹杰[47]等通過循環(huán)伏安法和交流阻抗法對電極的每一步修飾進(jìn)行了表征，其所構(gòu)建的電化學(xué)檢測技術(shù)的檢測范圍在10 pg/m L～1 g/m L之間，電極還原峰電流與乳鐵蛋白濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限可低至3.3 pg/m L。

循環(huán)伏安法檢測限低，檢測靈敏，準(zhǔn)確度高，但很容易受外界環(huán)境因素影響其實驗結(jié)果，需要專業(yè)人士操作。

2.4 表面等離子共振技術(shù)

當(dāng)入射光線以臨界角入射到兩種不同折射率的金屬介質(zhì)界面時，可以引起金屬產(chǎn)生自由的電子共振，使得反射光在一定角度內(nèi)減弱，其中能夠使反射光在一定角度內(nèi)完全小時的入射角我們稱為SPR角?？梢酝ㄟ^SPR角的變化，得到不同生物分子的特異性信號[48]。

Indyk[49]等通過表面等離子共振技術(shù)測定乳鐵蛋白，其檢測的濃度范圍在0～1×10-3mg/m L，最低檢測限達(dá)到0.0199m g/m L。

該方法樣品消耗較少、檢測準(zhǔn)確度高、可實現(xiàn)自動分析，但是該方法在運(yùn)用中其試驗溫度對測定結(jié)果影響較大，儀器設(shè)備造價也較為昂貴。

3 展望

乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，是一種優(yōu)質(zhì)的天然蛋白質(zhì)，乳鐵蛋白的抗氧化能力機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。抗氧化對于人體具有重要的意義，目前人工合成的抗氧化劑雖然具有清除自由基等作用，但研究表明，人工合成的抗氧化劑對人體具有致癌、導(dǎo)致肝部疾病等副作用，需要尋找一種天然的抗氧化劑，因此對乳鐵蛋白抗氧化功能的研究具有重要意義。另外乳鐵蛋白對鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)效率極高，是一種優(yōu)質(zhì)的補(bǔ)鐵劑，人工合成的無機(jī)補(bǔ)鐵劑通常對腸道會造成刺激，且補(bǔ)鐵效率低，目前，缺鐵是引起貧血癥狀的主要原因之一，通過對乳鐵蛋白補(bǔ)鐵機(jī)理的特性研究，嘗試研發(fā)出一種更為天然、安全、高效的補(bǔ)鐵劑。乳鐵蛋白具有的抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗癌等生物學(xué)功能的機(jī)理以及如何更好的利用乳鐵蛋白的功能性質(zhì)造福人類健康是未來的研究方向。

隨著人們對乳鐵蛋白的研究不斷加深，乳鐵蛋白的檢測技術(shù)也會隨著不斷發(fā)展。其不同檢測技術(shù)主要存在以下問題：從乳鐵蛋白檢測方法的適用范圍來看，現(xiàn)有的檢測方法通常只針對于基質(zhì)較為簡單的乳粉、乳鐵蛋白純化分離物、牛乳等，并沒有一種方法可以很好地適用于大多數(shù)乳制品或其他特色生鮮乳如牦牛乳、駱駝乳、山羊乳等。從乳鐵蛋白的前處理方法來看，對檢測乳鐵蛋白進(jìn)行的前處理主要是去除酪蛋白的影響，但除酪蛋白外還存在其它蛋白或核酸等，會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。另外從其實驗結(jié)果準(zhǔn)確度及可操作性、普適性來看，現(xiàn)有的乳鐵蛋白檢測技術(shù)在結(jié)果準(zhǔn)確度上還有待提高，液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等需要經(jīng)過專業(yè)實驗室以及專業(yè)人員操作，前處理復(fù)雜，需要的儀器設(shè)備價格昂貴；分光光度法其檢測結(jié)果準(zhǔn)確度有待提高；放射免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫吸附法及生物電化學(xué)法等受環(huán)境等外界因素影響較大。如何檢測多種乳產(chǎn)品的乳鐵蛋白以及如何更快捷、簡便的測定乳鐵蛋白是今后乳鐵蛋白檢測技術(shù)的發(fā)展方向。

相信隨著今后檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，建立一種準(zhǔn)確、快捷、經(jīng)濟(jì)、操作簡便的乳及乳制品中乳鐵蛋白檢測方法，彌補(bǔ)我國乳鐵蛋白檢測國家標(biāo)準(zhǔn)的空白，推進(jìn)對乳鐵蛋白的更深入的研究，推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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